水稻减数分裂基因OsXRCC3的克隆和功能鉴定

发布时间：2017-07-07 15:13

  本文关键词：水稻减数分裂基因OsXRCC3的克隆和功能鉴定

  更多相关文章： DNA双链断裂 同源重组 减数分裂 水稻 XRCC3

【摘要】：减数分裂是真核生物在有性生殖过程中发生的一种特殊的细胞分裂方式,其整个过程中染色体只复制一次而细胞连续分裂二次,最终形成染色体数目仅为性母细胞一半的配子。雌雄配子通过受精作用又恢复亲代的染色体数目,这样就保证了物种染色体数目的稳定。在减数分裂前期Ⅰ,同源染色体之间通过配对联会和重组等一系列复杂的相互作用而稳定在一起,从而保证了同源染色体在后期Ⅰ的准确分离。另外,在减数分裂过程中同源染色体的非姐妹染色单体之间发生了交换,使配子的遗传发生了多样化,增加了后代的适应性。在生物体中,同源重组过程中涉及到了很多基因。其中,RAD5是RecA重组酶的同源物,它催化单链的入侵和异源双链的形成。在动植物中都有RAD51的5个旁系同源基因(RAD51B、RAD51C、RAD51D、XRCC2和XRCC3),它们在同源重组过程扮演着重要的角色。RAD51家族在同源重组和维持基因组的完整性等方面起着重要作用,在不同的物种之间它们在功能上有所分化。在本研究中,我们通过图位克隆的方法在水稻克隆了影响重组的OsXRCC3基因。xrcc3突变体营养生长正常,但是雌雄配子完全不育。细胞学观察发现在xrcc3突变体中同源染色体不能正常配对和联会。染色体在中期Ⅰ发生相互缠绕,导致在后期Ⅰ形成大量的染色体碎片。免疫荧光染色反应发现突变体中γH2AX的信号正常,说明DNA双链断裂在xrcc3突变体中能正常形成。然而,COM1不能正常定位到染色体上,说明双链断裂末端的加工过程在xrcc3突变体中受到影响。并且在xrcc3突变体中,同源重组过程中的标记蛋白RAD51C、DMC1、ZIP4和MER3不能正常定位到染色体上,也进一步证明了在xrcc3突变体中同源染色体的重组不能正常进行。另外,我们还发现在xrcc3的突变体中,联会复合体的轴向元件REC8、PAIR2和PAIR3能够正常定位到染色体上,而横向元件ZEP1在染色体上不能正常定位,说明在突变体中联会复合体不能正常形成。因此,我们认为XRCC3在水稻DNA双链断裂末端加工、同源染色体联会和重组过程中起着重要作用。此外,我们发现XRCC3还参与了丝裂霉素C介导的有丝分裂的DNA损伤修复。
【关键词】：DNA双链断裂 同源重组 减数分裂 水稻 XRCC3
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩写略表9-11
• 第一章 文献综述11-33
• 1.1 减数分裂及其生物学意义11
• 1.2. 减数分裂的过程11-15
• 1.2.1 减数分裂的间期(pre-meiotic interphase)11
• 1.2.2 前期Ⅰ(prophase Ⅰ)11-13
• 1.2.3 中期Ⅰ(metaphase Ⅰ)13
• 1.2.4 后期Ⅰ(anaphase Ⅰ)13
• 1.2.5 末期Ⅰ(telophase Ⅰ)13
• 1.2.6 减数分裂Ⅱ13-15
• 1.3 减数分裂前期Ⅰ发生的重要生物学事件15
• 1.4 同源重组机制15-17
• 1.4.1 同源重组双链断裂修复模型16-17
• 1.5 参与同源重组的蛋白17-25
• 1.5.1 参与DSB形成的相关蛋白：SPO11及其辅助蛋白17-20
• 1.5.2 参与DSB加工的蛋白：MRX复合体和COM1/SAE2/CtIP20
• 1.5.3 参与单链入侵和异源双链形成的蛋白：RAD51、DMC1及其辅助蛋白20-22
• 1.5.4 参与交叉形成的蛋白22-25
• 1.6 DSB双链断裂修复机制25-27
• 1.7 联会复合体的形成27-29
• 1.8 植物减数分裂的研究29-32
• 1.9 论文研究意义和目标32-33
• 1.9.1 研究意义32
• 1.9.2 研究目标32-33
• 第二章 材料与方法33-44
• 2.1 实验材料33-34
• 2.1.1 水稻材料33
• 2.1.2 质粒及菌株33
• 2.1.3 工具酶及各种生化试剂33
• 2.1.4 本研究所用蛋白的序列号(accession number)33-34
• 2.2 实验方法34-44
• 2.2.1 水稻总DNA的提取34
• 2.2.2 分子标记的开发与基因的图位克隆34
• 2.2.3 水稻总RNA的提取和cDNA反转录34-35
• 2.2.4 半定量RT-PCR分析35-36
• 2.2.5 质粒DNA小量提取36-37
• 2.2.6 农杆菌电击感受态的制备37
• 2.2.7 电击转化农杆菌37-38
• 2.2.8 互补载体的构建及水稻基因转化38-40
• 2.2.9 潮霉素抗性鉴定与转基因阳性苗的鉴定40-41
• 2.2.10 减数分裂时期染色体的制备41
• 2.2.11 荧光原位杂交实验41-43
• 2.2.12 染色体蛋白质免疫检测43-44
• 第三章 结果与分析44-69
• 3.1 Osxrcc3-1突变体的分离44-45
• 3.2 突变体的遗传分析45-46
• 3.3 OsXRCC3基因的图位克隆46-52
• 3.4 功能互补验证52-53
• 3.5 OsXRCC3基因的突变导致减数分裂发生异常53-56
• 3.6 在Osxrcc3-1突变体中同源染色体不能配对56-57
• 3.7 在Osxrcc3-1突变体中,DSB能够正常形成57-59
• 3.8 在Osxrcc3-1突变体中,联会复合体不能正常的装配59-62
• 3.9 COM1,RAD51C和DMC1在染色体上的定位依赖于XRCC362-63
• 3.10 XRCC3对于MER3和ZIP4在染色体上的定位是必须的63-67
• 3.11 OsXRCC3突变导致幼苗对丝裂霉素C敏感性增加67-69
• 第四章 讨论69-72
• 4.1 XRCC3蛋白在水稻同源染色体的联会和重组过程中起着非常重要的作用69
• 4.2 在不同生物体中XRCC3功能的保守与分化69-70
• 4.3 Osxrcc3突变体中可能发生了非同源染色体的重组70-72
• 第五章 结论与展望72-73
• 5.1 结论72
• 5.2 研究展望72-73
• 参考文献73-83
• 附录83-85
• 致谢85-87
• 博士在读期间发表的论文87
• 博士在读期间申请的专利87

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本文编号：530731