优化设计并人工合成的纳豆激酶基因在甜瓜和番茄中的高效表达

发布时间：2017-07-18 12:10

  本文关键词：优化设计并人工合成的纳豆激酶基因在甜瓜和番茄中的高效表达

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【摘要】：纳豆激酶(nattokinase,NK)是由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis var. natto)分泌的一种碱性蛋白酶,其活性发挥依赖直接和间接两种途径,具有很强的溶解血栓纤维蛋白的活性。其安全、可口服、方便有效等优点,使得它作为一种新型的口服溶栓剂,在预防和治疗心血管疾病方面具有很好的应用前景。本论文克隆了纳豆枯草杆菌来源的纳豆激酶基因aprN(eNK),根据植物密码子的使用频率,以不改变NK氨基酸序列为前提,重新优化设计该基因,获得了人工合成的纳豆激酶基因sNK。利用重叠延伸PCR技术,在上述两种基因中插入番茄果实特异性表达基因E8的第一内含子构成eNKi和sNKi基因。在上述四种基因的起始密码子ATG前插入Kozak序列,以植物双元表达载体pPZP221(35S-nos)为构建的初始载体,将这四种纳豆激酶基因——-eNK、eNKi、 sNK和sNK1分别克隆到组成型表达的CaMV 35S启动子和果实特异性表达的E8启动子下游,构建8种植物表达载体：p35S-eNK、pE8-eNK、p35S-eNKi、 pE8-eNKi、p35S-sNK、pE8-sNK、p35S-sNKi和pE8-sNKi,冻融法转化农杆菌LBA4404。通过农杆菌渗透法将四种纳豆激酶基因注射到甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)果实中并实现瞬时表达。通过正交试验摸索得到在甜瓜果实中瞬时表达纳豆激酶基因的最优条件：乙酰丁香酮浓度为250μmol/L、农杆菌浓度OD600=0.6及注射后5天采收果实,纳豆激酶的表达量最高。通过实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)比较四种基因在不同成熟时期的甜瓜果实中转录水平的表达量；通过纤维蛋白平板法检测四种基因表达产物的纤溶酶活性。RT-qPCR结果表明,经密码子优化的sNK和sNKi基因的表达量显著高于未改造的eNK和eNKi基因的表达量,其中35S启动子调控下的sNK因平均表达量为eNK因的8.64倍,而E8启动子调控下的sNKi基因则为eNKi基因平均表达量的10.93倍。E8启动子调控下的sNK和iNKi基因的表达量较组成型35S启动子调控下的该基因的表达量明显提高,在果实成熟中期表达量达到最高。内含子在sNKi基因的转录后加工过程中能够被正确的剪切掉,sNKi基因和sNK基因的转录产物相同,但sNKi基因的表达量高于无内含子的sNK基因,表明内含子对纳豆激酶基因的瞬时表达具有显著的促进作用。纤溶酶活性测定结果与RT-qPCR结果基本一致,纤维蛋白平板法在sNKK和sNKi基因的瞬时表达样品中均能检测到纤溶酶活性,表明目的基因在甜瓜果实中可正常翻译并表现出溶栓活性,且E8启动子调控下的sNKi基因表达产物的纤溶酶活性最高,可达237.90 U/g。将sNK和iNKi基因瞬时转化Moneymaker和Micro-Tom番茄(Lycopersicon esculentum Mill)果实,其纳豆激酶基因的表达情况和甜瓜中类似。sNK和sNKi基因在番茄果实的转色期、成熟期和完熟期都能表达,其中成熟期表达量最高,破色期基本无表达。在E8启动子的调控下,sNKi基因表达的最高纤溶酶活可达144.27 U/g。通过农杆菌侵染的方法将sNK和sNKi基因稳定转化到Moneymaker、M82和Micro-Tom三种番茄中。T0代转基因番茄经PCR检测,分别得到转p35S-sNK番茄32株,转pE8-sNK番茄27株,转p35S-sNKi番茄21株和转pE8-sNKi番茄27株,初步证明目的基因已整合到番茄基因组中。经加代培养得到T,代转基因番茄植株,在转p35S-sNK番茄中,有11株检测到转录水平的表达,7株检测到纤溶酶活性；在转pE8-sNK番茄中,有12株检测到转录水平的表达,8株检测到纤溶酶活性；在转p35S-sNKi番茄中,有8株检测到转录水平的表达,6株检测到纤溶酶活性；在转pE8-sNKi番茄中,有11株检测到转录水平的表达,10株检测到纤溶酶活性。其中,Moneymaker番茄的ADl-3植株表达产物的纤溶酶活性最高,为30.69 U/g。将表达出纤溶活性的T1代转基因番茄继续加代培养,得到T2代转基因番茄,检测到纳豆激酶基因表达的共有转p35S-sNK番茄9个株系、28个植株,转pE8-sNK番茄8个株系、27个植株,转p35S-sNKi番茄8个株系、25个植株和转pE8-sNKi番茄10个株系、36个植株。其中, Moneymaker番茄的AD1-3-3植株表达的纤溶酶活性可高达63.90U/g。
【关键词】：纳豆激酶 密码子优化 内含子 瞬时表达 番茄 甜瓜
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 符号说明13-15
• 第一章 文献综述15-34
• 1.1 纳豆激酶及其基因的研究进展15-24
• 1.1.1 纳豆激酶及其基因的分子结构15-16
• 1.1.2 纳豆激酶的理化性质16-17
• 1.1.3 纳豆激酶的溶栓活性与活性测定方法17-21
• 1.1.4 纳豆激酶基因表达的研究21-22
• 1.1.5 纳豆激酶的应用前景22-24
• 1.2 外源基因在转基因植物中高效表达的研究进展24-26
• 1.2.1 蛋白质靶向定位24
• 1.2.2 优化外源基因密码子24-25
• 1.2.3 启动子的选择和改造25
• 1.2.4 添加5’和3’非编码序列25-26
• 1.2.5 使用核基质附着区(MARs)序列26
• 1.2.6 插入内含子26
• 1.3 植物生物反应器生产药用蛋白的研究进展26-32
• 1.3.1 植物生物反应器的优点27
• 1.3.2 植物表达系统27-31
• 1.3.3 植物生物反应器的应用31-32
• 1.4 本研究的目的和意义32-34
• 第二章 纳豆激酶基因密码子的优化设计、合成及植物表达载体的构建34-54
• 2.1 材料和试剂34-35
• 2.1.1 菌种、质粒34-35
• 2.1.2 主要试剂35
• 2.1.3 溶液和培养基配方35
• 2.2 实验方法35-44
• 2.2.1 纳豆激酶基因eNK的克隆35-37
• 2.2.2 纳豆激酶基因eNKi的构建37-39
• 2.2.3 纳豆激酶基因sNK的设计与合成39-40
• 2.2.4 纳豆激酶基因sNKi的构建40-41
• 2.2.5 纳豆激酶基因eNK,eNKi和sNK,sNKi植物表达载体的构建41-44
• 2.3 结果与分析44-52
• 2.3.1 eNK基因的克隆与eNKi基因的构建结果44-46
• 2.3.2 sNK基因的合成与sNKi基因的构建结果46-49
• 2.3.3 eNK和eNKi基因植物表达载体的获得49-51
• 2.3.4 sNK和sNKi基因植物表达载体的获得51-52
• 2.4 讨论52-54
• 第三章 人工合成的纳豆激酶基因在甜瓜和番茄果实中的瞬时表达54-79
• 3.1 材料和试剂55-56
• 3.1.1 植物材料55
• 3.1.2 菌种、质粒55
• 3.1.3 主要试剂55
• 3.1.4 引物设计55-56
• 3.1.5 溶液和培养基配方56
• 3.2 实验方法56-64
• 3.2.1 植物表达载体转化农杆菌LBA440456-58
• 3.2.2 甜瓜果实瞬时表达系统的建立58-62
• 3.2.3 番茄果实瞬时表达系统的建立62-64
• 3.3 结果与分析64-76
• 3.3.1 转纳豆激酶基因植物表达载体农杆菌的获得64-65
• 3.3.2 纳豆激酶基因在甜瓜果实中瞬时表达的分析65-73
• 3.3.3 纳豆激酶基因在番茄果实中瞬时表达的分析73-76
• 3.4 讨论76-79
• 第四章 人工合成的纳豆激酶基因在番茄中的稳定表达79-102
• 4.1 材料和试剂82-83
• 4.1.1 植物材料82
• 4.1.2 菌种、质粒82
• 4.1.3 主要试剂82
• 4.1.4 引物82
• 4.1.5 溶液和培养基配方82-83
• 4.2 实验方法83-88
• 4.2.1 番茄组织培养再生体系的建立83-84
• 4.2.2 番茄遗传转化体系的建立84-86
• 4.2.3 T_0代转基因番茄植株的检测86-87
• 4.2.4 转基因番茄植株的加代培养87-88
• 4.3 结果与分析88-100
• 4.3.1 番茄高效组织培养再生体系的获得88-91
• 4.3.2 纳豆激酶基因转化番茄实验结果91-94
• 4.3.3 T_0代转基因番茄植株的获得94-96
• 4.3.4 T_1代转基因番茄植株的获得与表达分析96-99
• 4.3.5 T_2代转基因番茄植株的获得与表达分析99-100
• 4.4 讨论100-102
• 结论102-103
• 参考文献103-113
• 致谢113-114
• 攻读博士学位期间论文发表情况114

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本文编号：557628