极端耐NaHCO_3微藻的鉴定及ACBP抗逆机制研究
发布时间：2017-07-27 00:05
本文关键词：极端耐NaHCO_3微藻的鉴定及ACBP抗逆机制研究
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【摘要】：在中国东北,大规模的土地开垦和过度放牧引起土壤侵蚀和流失,造成土壤表面的盐分积累。松嫩平原土壤主要盐分为碳酸钠和碳酸氢钠,俗称“苏打盐碱土”。Na2CO3和NaHCO3给植物带来的逆境叫做“碳酸盐逆境”。严重盐碱化区有许多“不毛之地”(pH约10.5),只有少数的植物零星分布,定义为极端盐碱土壤环境。对富含碳酸盐逆境的极端盐碱土壤微藻的分类鉴定和分子机制的研究,目的是探索藻类的碳酸盐逆境机制和获取可能的极端耐盐碱微藻作为作物改良和栽培的遗传资源。1.极端盐碱环境特殊微藻资源的分离鉴定解析(1)从极端盐碱土壤环境分离的20种微藻,基于光学显微镜和扫描电镜观察其形态结构,结果发现20种微藻形态多样,包括单细胞、定性群体和丝状体等。(2)为进一步对形态学分类进行校正和补充,通过18S rRNA基因序列分类鉴定微藻。结果显示20种微藻分为6个纲和13个属。(3)为获得极端耐盐碱微藻资源,通过NaCl和NaHCO3处理来检测微藻的长势。利用透射电镜(TEM)观察处理后藻类细胞超微结构变化。检测NaHCO3处理下的长势、干重和叶绿素a含量。结果显示大多数藻类都具有耐盐性,尤其是2个属于共球藻纲的微藻(JB6和17)。TEM结果表明逆境处理下JB6和17的细胞壁比对照小球藻稳定性强。长势、干重和叶绿素a含量明显高于对照,且在1000 mM NaHCO3也能生存。结果表明,获得2个极端耐受NaHCO3的微藻。2.耐盐碱小球藻全长cDNA文库构建及耐NaHCO3基因筛选(1)为构建耐NaHCO3小球藻cDNA文库,通过cDNA Library Construction Kit合成全长cDNA双链,通过PCR的方式获得pYES2线性载体。利用In-Fusion技术将载体与cDNA连接,转化酵母菌株获得全长cDNA文库。(2)为获得与NaHCO3胁迫相关基因,通过NaHCO3逆境筛选耐性转基因酵母,分离耐NaHCO3小球藻基因。结果共筛选出20个与NaHCO3胁迫相关基因,长度分布在500-2000 bp之间。Gene Ontology (GO)注释结果显示这些基因与生物过程(2)、应激反应(7)、代谢(2)、生物调节(2)、细胞过程(7)和定位(2)相关。7个属于与高盐、氧化、重金属和有毒物等胁迫响应相关基因。3.酰基辅酶A结合蛋白基因(ACBP)抗逆机制研究(1) ACBP基因从耐NaHCO3小球藻cDNA文库筛选获得。为了解ACBP基因(ChACBP)特性,通过生物信息学方法对基因进行分析,结果显示cDNA全长为525bp,开放阅读框为264 bp,编码87个氨基酸。与已发表的其他物种ACBP序列的相似性在50-82%之间。ChACBP重组蛋白能特异结合磷脂酰胆碱(PC)。(2)为检测ChACBP基因与非生物胁迫应答关系,northern杂交分析表明ChACBP基因受多种非生物胁迫如高盐、氧化、重金属和低温诱导表达量增加。(3)为验证ChACBP基因的抗逆性,通过逆境处理过表达ChACBP基因的酵母和拟南芥,结果显示ChACBP具有提高耐高盐、氧化、重金属和低温胁迫能力。综上所述,这些结果显示ChACBP基因有提高植物耐受非生物胁迫的可能性。蛋白结合实验暗示ChACBP可能参与小球藻的磷脂代谢,包括可能在细胞质基质中结合并运输PC,并可能在保护细胞膜的稳定性上发挥重要作用。这些研究为筛选具有特殊抗逆特征的藻类种质资源提供理论基础,为探究藻类的耐盐碱分子机理并获得潜在的耐盐碱基因为作物育种提供遗传资源。
【关键词】：极端盐碱土 微藻鉴定 耐NaHCO_3微藻 酰基辅酶A结合蛋白 Northern杂交 抗性分析 脂类互作
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q949.2
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-15
- 1 绪论15-28
- 1.1 引言15-16
- 1.2 微藻的分类16-17
- 1.2.1线粒体基因组与分子分类16
- 1.2.2 叶绿体基因姐与分子分类16
- 1.2.3 核基因组与分子分类16-17
- 1.3 cDNA文库的构建17-18
- 1.4 憸基辅酶A结合蛋白(AGBP)18-26
- 1.4.1 植物憸基辅酶A蛋白20-23
- 1.4.2 在植物生长中的拟南芥憸基辅酶A结合蛋白23-24
- 1.4.3 拟南芥acyl-GoA-bitiding蛋白质在胁迫下反应24-25
- 1.4.4 拟南芥憸基辅酶A结合蛋白在脂质代谢的作用25-26
- 1.4.5 结论和观点26
- 1.5 本研巧的目的和意义26-28
- 2 极端盐巧环巧特殊巧藻资源的分离鉴定解祈28-43
- 2.1 实验材料28
- 2.2 实验方法28-30
- 2.2.1 形态学观察28-29
- 2.2.2 DNA提取和PCR29
- 2.2.3 序列分析29
- 2.2.4 抗性分析29-30
- 2.2.5 不同浓度化HC0_3微藻长势、干重和叶绿素a测定30
- 2.3 结果与分析30-40
- 2.3.1 极端盐碱藻的形态描述30-35
- 2.3.2 18S rRNA系统进化分析35-37
- 2.3.3 极端盐碱±壤藻类抗逆特性分析37-39
- 2.3.4 NaHCO_3胁迫下共球藻纲的2个藻生物量特性分析39-40
- 2.4 讨论40-41
- 2.4.1 极端盐碱微藻的鉴定40-41
- 2.4.2 2个极端耐NaHGO_3藻的发现41
- 2.5 本章小结41-43
- 3 耐盐碱小巧巧全长cDNA文库构建及尅NaHCO_3基因筛选43-58
- 3.1实验材料43-44
- 3.2实验方法44-51
- 3.2.1小球藻全长cDNA文库构建44-49
- 3.2.2抗逆转基因酵母筛选和耐盐碱基因的获得49-51
- 3.2.3序列分析51
- 3.3 结果51-56
- 3.3.1 cDNA文库的鉴定51-53
- 3.3.2 抗逆基因筛选和分析53-56
- 3.4讨论56-57
- 3.5本章小结57-58
- 4 耐盐碱小球藻ACBP基因的抗逆机制研究58-79
- 4.1 材料和方法58-65
- 4.1.1 基因的获得和分析58
- 4.1.2 转基因酵母抗逆性分析58
- 4.1.3 ChACBP的表达分析58-60
- 4.1.4 ChACBP在真核细胞中的定位60-61
- 4.1.5 ChACBP过表达植株的制备61
- 4.1.6 过表达植株的非生物胁迫耐受性分析61-62
- 4.1.7 电导率分析62
- 4.1.8 ChACBP重姐蛋白纯化和结合x镏笛，
本文编号：578940
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