唾液乳杆菌Ren抗胆盐胁迫反应机制及转录因子TF0225在胆盐胁迫应激中的作用

发布时间：2017-08-03 11:25

  本文关键词：唾液乳杆菌Ren抗胆盐胁迫反应机制及转录因子TF0225在胆盐胁迫应激中的作用

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【摘要】：唾液乳杆菌是人体肠道内的原籍菌,具有多种益生功效。肠道内的胆盐具有杀菌作用,能够破坏细菌的细胞膜结构,造成蛋白质错误折叠和DNA氧化损伤,因此能够耐受生理条件下的胆盐胁迫是唾液乳杆菌在人体内发挥益生作用的必要条件。本研究采用转录组学与蛋白组学相结合的手段,对长寿老人源Lactobacillus salivarius Ren胆盐胁迫反应中的差异表达基因和蛋白质进行分离鉴定,并对其中关键转录因子及其靶基因进行功能分析,实验结果为全面揭示L. salivariusRen的胆盐胁迫应激机制提供理论基础,研究内容如下：(1) L. salivarius Ren胆盐胁迫条件下转录组和蛋白组图谱的建立。将L. salivarius Ren在含有0.07%牛胆盐(Oxgall)的MRS中进行培养,应用基于第二代高通量测序的RNA-Seq方法筛选了192个转录水平显著变化的基因(log2 fold_change≥1.5,p0.001),其中47个基因的转录水平上调,145个基因下调。同时采用蛋白质双向电泳(2-DE)和质谱鉴定分离了44个胞内可溶性差异表达蛋白点(fold_change≥1.25,p0.05),其中表达丰度上调的蛋白点15个,下调29个；并且31个蛋白点在翻译水平和转录水平同时呈现上调或下调。结果表明L. salivarius Ren的胆盐胁迫响应是一个复杂的调控网络。(2)生物信息学分析预测L. salivarius Ren的胆盐胁迫应激机制。利用Uniprot、KEGG及NCBI等数据库分析差异表达基因和蛋白质的功能及参与的代谢通路,提出了L. salivarius Ren的胆盐胁迫应激机制,主要包括：对麦芽糖和甘油的利用加强,加速糖酵解以提高能量物质的产生；增加赖氨酸与苏氨酸的合成,以加强对细胞表面的修饰提高细胞膜的稳定性；转运蛋白的合成上调以加速胆盐的泵出；提高分子伴侣与氧化还原酶的合成,应对胆盐造成的蛋白变性和氧化损伤；基因转录和翻译、细胞分裂增殖及脂肪酸合成等进程减慢；通过转录因子及双组分系统调控细胞生理变化,以适应胆盐胁迫环境。(3)转录因子TF0225在L. salivarius Ren胆盐胁迫应激中的调控机制。将TF0225在L.salivarius Ren中进行同源超量表达,胆盐耐受实验表明转录因子超量表达菌株对0.5%胆盐的耐受能力是对照菌株的23倍。进一步利用细菌单杂交和MEME工具预测了TF0225的DNA结合位点保守基序STKGMCA,并通过Target Explorer在L. salivarius Ren中筛选了16个TF0225的靶基因。采用RT-qPCR分析了关键靶基因.oppA的转录水平,结果表明转录因子超量表达菌株中oppA的转录水平显著下调2.33倍,证实了TF0225对oppA的负调控作用。(4)靶基因oppA在L. salivarius Ren胆盐胁迫抗性中的功能分析。将oppA基因在L. salivariusRen中进行同源超量表达,胆盐耐受实验表明oppA超量表达的重组菌株对0.5%胆盐的耐受能力是对照菌株的20倍。单一成份胆盐(GCA、GDCA、TCA和TDCA)的耐受实验表明OppA可赋予重组菌株对牛磺酸结合胆盐特异的抗性。此外,OppA的超量表达还可显著提高L. salivarius Ren对高盐(7.5% NaCl)及高温(55。C)胁迫的耐受能力。这些结果表明OppA在L. salivarius Ren对抗多重胁迫的过程中发挥保护作用。综上所述,本研究首次采用了转录组学和蛋白组学相结合的方法,全面分析了L. salivariusRen胆盐胁迫条件下基因与蛋白的差异表达情况,为揭示L. salivarius的胆盐胁迫应激机制提供了新的依据。
【关键词】：唾液乳杆菌 胆盐胁迫 RNA-Seq 蛋白质双向电泳 转录因子
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q933
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 缩略词表13-15
• 第一章 引言15-25
• 1.1 唾液乳杆菌及其益生功效15
• 1.2 L.salrvarius Ren简介15
• 1.3 肠道内的胆盐及胆盐胁迫15-17
• 1.3.1 人体内胆盐的组成与代谢16-17
• 1.3.2 胆盐对细菌的毒害作用17
• 1.4 乳杆菌的胆盐胁迫抗性机制17-19
• 1.4.1 胆盐水解酶17-18
• 1.4.2 细胞膜结构的改变18
• 1.4.3 胆盐转运系统18-19
• 1.5 乳杆菌胆盐胁迫应激机制的组学研究19-20
• 1.6 胆盐胁迫应激中的转录调控机制研究20-22
• 1.6.1 转录因子与乳杆菌胆盐胁迫应激20-21
• 1.6.2 细菌单杂交21-22
• 1.7 本研究的目的及意义22-25
• 1.7.1 研究目的意义22-23
• 1.7.2 研究内容23-24
• 1.7.3 技术路线24-25
• 第二章 L.salivarius Ren胆盐胁迫条件下转录组和蛋白组图谱的建立25-46
• 2.1 材料与试剂25-27
• 2.1.1 菌株25
• 2.1.2 试剂25
• 2.1.3 试剂的配制25-26
• 2.1.4 仪器设备26-27
• 2.2 实验方法27-31
• 2.2.1 L.salivarius Ren胆盐胁迫处理条件的确定27
• 2.2.2 L.salivarius Ren胆盐胁迫条件下转录组的测定27-28
• 2.2.3 转录组测序数据的处理28
• 2.2.4 L.salivarius Ren胆盐胁迫条件下蛋白组的测定28-30
• 2.2.5 蛋白组数据的处理30-31
• 2.2.6 数据统计分析31
• 2.3 结果与分析31-45
• 2.3.1 L.salivarius Ren胆盐胁迫条件的确定31-32
• 2.3.2 L.salivarius Ren胆盐胁迫条件下转录谱的建立32-39
• 2.3.3 L.salivarius Ren胆盐胁迫条件下蛋白质图谱的建立39-41
• 2.3.4 差异表达蛋白的质谱鉴定41-45
• 2.4 讨论45-46
• 第三章 生物信息学预测L.salivarius Ren的胆盐胁迫应激机制46-54
• 3.1 生物信息学分析工具46
• 3.2 生物信息学分析方法46
• 3.3 结果与讨论46-54
• 3.3.1 中心代谢途径的调整46-49
• 3.3.2 胆盐胁迫抗性机制49-51
• 3.3.3 普遍胁迫响应机制51
• 3.3.4 基因转录、翻译及菌体增殖减缓51-52
• 3.3.5 转录调控因子的变化52-53
• 3.3.6 未知功能基因53-54
• 第四章 转录因子TF0225在L.salivarius Ren胆盐胁迫应激中的功能分析54-80
• 4.1 材料与试剂54-60
• 4.1.1 菌株和质粒54-55
• 4.1.2 试剂55
• 4.1.3 试剂的配制55-60
• 4.1.4 仪器设备60
• 4.2 实验方法60-70
• 4.2.1 转录因子TF0225同源超量表达重组菌株的构建60-63
• 4.2.2 TF0225超量表达菌株胆盐耐受能力分析63-64
• 4.2.3 细菌单杂交诱饵载体pB 1H2w2-25的构建64
• 4.2.4 Western blot检测Omega-0225融合蛋白的表达64-66
• 4.2.5 细菌单杂交预测TF0225的DNA结合序列66-67
• 4.2.6 生物信息学分析预测TF0225的靶基因67-68
• 4.2.7 RT-qPCR检测TF0225对靶基因oppA的转录调控68-70
• 4.3 结果与分析70-79
• 4.3.1 转录因子TF0225同源超量表达载体的构建70-72
• 4.3.2 重组菌株胆盐胁迫耐受能力分析72-73
• 4.3.3 转录因子TF0225在细菌单杂交宿主E.coli USO中的表达73-74
• 4.3.4 细菌单杂交预测TF0225的DNA识别序列74-75
• 4.3.5 Target Explorer预测TF0225调控的靶基因75-77
• 4.3.6 RT-qPCR验证TF0225对靶基因oppA的调控77-79
• 4.4 讨论79-80
• 第五章 靶基因oppA在L.salivarius Ren胆盐胁迫抗性中的功能分析80-92
• 5.1 材料与试剂80-82
• 5.1.1 菌株和质粒80
• 5.1.2 试剂80-81
• 5.1.3 试剂的配制81
• 5.1.4 仪器设备81-82
• 5.2 实验方法82-85
• 5.2.1 oppA基因的PCR扩增82
• 5.2.2 重组质粒p11-oppA的构建82-83
• 5.2.3 oppA超量表达菌株的构建83
• 5.2.4 OppA蛋白物理化学性质预测83
• 5.2.5 SDS-PAGE检测OppA蛋白的超量表达83-84
• 5.2.6 重组菌株LSRoppA胆盐胁迫抗性能力分析84
• 5.2.7 重组菌株LSRoppA对单组分胆盐的耐受偏好性分析84
• 5.2.8 重组菌株LSRoppA对于其他胁迫的耐受能力分析84-85
• 5.3 结果与分析85-90
• 5.3.1 oppA基因的扩增85
• 5.3.2 OppA超量表达重组质粒的构建85-86
• 5.3.3 OppA超量表达菌株的构建86
• 5.3.4 OppA蛋白序列分析86-87
• 5.3.5 SDS-PAGE检测OppA蛋白的超量表达87-88
• 5.3.6 重组菌株LSRoppA胆盐胁迫抗性能力分析88-89
• 5.3.7 重组菌株LSRoppA对单组分胆盐的耐受偏好性分析89
• 5.3.8 重组菌株LSRoppA对于其他胁迫的耐受能力分析89-90
• 5.4 讨论90-92
• 第六章 全文总结与展望92-95
• 6.1 全文总结92
• 6.2 创新点92-93
• 6.3 展望93-95
• 参考文献95-102
• 致谢102-103
• 附录103-105
• 个人简介105

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 孟祥晨;李雪;姚蕾;周金雨;;两株植物乳杆菌作为潜在益生菌的体外评价[J];东北农业大学学报;2015年09期

2 敖晓琳;蒲彪;蔡义民;胡爱华;陈岑;陈安均;;发酵乳杆菌及其益生特性研究进展[J];食品与生物技术学报;2015年02期

3 周建良;徐中文;李浩;李慧梅;刘智伟;方祥;;唾液乳杆菌LB-2P发酵培养基的响应面分析优化[J];中国食品学报;2015年07期

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1 杜新永;产α-半乳糖苷酶唾液乳杆菌XH4B筛选、性质、应用及高密度培养研究[D];浙江大学;2014年

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本文编号：614162