超积累植物东南景天Cd耐性和积累的分子机制

发布时间：2017-08-15 19:11

  本文关键词：超积累植物东南景天Cd耐性和积累的分子机制

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【摘要】：近年来,由于土壤重金属污染情况日益严重,因此对重金属超积累作用机理的研究是当今国内外研究的热点。本研究探究了超积累植物东南景天对镉的耐性和积累机制。本研究在前期转录组测序的基础上,发掘出一些可能与镉超积累植物东南景天镉超积累作用相关的基因,并综合利用分子克隆、生物信息学分析、RT-PCR、酵母功能互补、植物过表达、洋葱表皮细胞定位等手段对它们的功能进行了研究,并探讨了它们在东南景天镉耐性和积累过程中的作用以及东南景天镉耐性和积累的机理。本研究所取得的主要研究结果如下：1、通过同源克隆技术,克隆到一个东南景天P-1B型ATP酶基因(SaHMA3)。超积累生态型与非超积累生态型东南景天SaHMA3基因都表现出在根系和地上部组成型表达,并且都编码液泡膜上定位的转运子,但是不同之处在于其转运底物的选择性及表达水平差异。超积累生态型东南景天SaHMA3h是一个镉的特异转运子,而非超积累生态型SaHMA3n既能转运镉也能转运锌。从表达水平来看,SaHMA3在超积累生态型不管是根系还是地上部的表达水平都显著高于非超积累生态型；而且,在超积累生态型体内,SaHMA3在地上部的表达量要明显高于根部。过表达SaHMA3h显著提高了烟草植物对镉的耐性和积累量,但是降低了镉从根部向地上部的转运。由此可见,东南景天SaHMA3在东南景天镉耐性及积累过程中起着重要的作用。2、SaMT2基因编码一个含79个氨基酸残基的蛋白,其包含两个富含半胱氨酸的结构域。在东南景天体内,SaMT2的表达水平表现为地上部高于根部,并且显著地受镉和锌处理的诱导。酵母功能互补实验表明SaMT2可以显著地提高酵母对镉的积累与耐性,而不能提高对锌的耐性。将SaMT2在烟草中过表达后发现,过表达SaMT2的烟草根部和地上部对镉的积累及耐性都有明显提高。在镉处理条件下,转基因烟草相比野生型植物具有更高的抗氧化酶活性,更少的过氧化氢积累。因此,本研究表明东南景天SaMT2可以通过与金属结合和改善抗氧化系统来提高转基因烟草对镉的耐性和积累。3、NRAMP家族(Natural Resistance-Associated Macrophage Proteins)蛋白是一类广泛存在于植物、动物、微生物体内的铁、锰、镉等金属的转运蛋白,在铁、锰、镉等金属离子的稳态过程中起重要的作用。本研究在前期课题组对东南景天转录组测序的基础上,分析挖掘出五个NRAMP家族基因,并利用生物信息学、RT-PCR、酵母功能互补、植物过表达、洋葱表皮细胞定位等技术对东南景天NRAMP家族基因的功能进行了研究,探讨了它们与东南景天镉转运之间的关系。结果表明,这5个NRAMP家族基因所编码的氨基酸序列相互之间同源性表现出比较大的差异,它们之间的相似度在30%-84%之间,其中SaNramp3和SaNramp4之间的相似度最高,达到了接近84%。同其它植物的NRAMP蛋白一样,东南景天的NRAMP都包含12个跨膜结构域以及一个保守程度非常高的转运结构域,位于第8和第9个跨膜域之间。进化树分析发现,NRAMP家族的蛋白可以分成两个亚组,其中SaNramp1和SaNramp6属于一个亚组,而SaNramp2、 SaNramp3和SaNramp4属于另一个亚组。东南景天NRAMP家族基因在表达水平上存在比较大的差异,其中SaNramp3表达量最高。超积累生态型中SaNrampl. SaNramp3、SaNramp6都在地上部表达量比较高,根部表达量较低。在超积累生态型中这些基因的表达水平受金属的调控较小,在非超积累生态型中,SaNrampl则显著受镉处理的诱导,然而SaNramp3显著受锌、镉及缺铁处理的诱导,SaNramp6在不同金属处理下变化不大。洋葱表皮细胞定位试验发现SaNrampl、 SaNramp6定位于细胞膜上,而SaNramp3定位于液泡膜上。酵母功能互补及植物过表达试验表明SaNrampl是一个镉、锰、锌的转运子,SaNramp3是一个镉、锰、铁的转运子,而SaNramp6是一个镉和锰的转运子。因此,可见东南景天NRAMP家族蛋白在镉的转运积累过程中起重要的作用。
【关键词】：超积累植物 镉 HMA3 MT2 NRAMP 分子机制
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X173;Q945.78
【目录】：

• 致谢7-11
• 中文摘要11-13
• ABSTRACT13-16
• 主要缩略词表16-17
• 第一章 文献综述17-33
• 1.1 镉等重金属的危害、污染现状及应对措施17-20
• 1.1.1 镉等重金属的危害17-18
• 1.1.2 土壤中重金属的污染现状18-19
• 1.1.3 应对措施19-20
• 1.2 植物超积累重金属的机理研究进展20-27
• 1.2.1 超积累植物20-21
• 1.2.2 植物重金属的超积累机理研究进展21-27
• 1.3 重金属积累与耐性相关基因研究进展27-30
• 1.4 本研究的意义及研究内容30-33
• 第二章 东南景天镉耐性与HMA3基因功能的关系研究33-55
• 摘要33
• 2.1 引言33-35
• 2.2 材料及方法35-40
• 2.2.1 植物材料与培养35-36
• 2.2.2 SaHMA3基因的克隆36
• 2.2.3 SaHMA3基因的表达分析36-37
• 2.2.4 Southern blot分析37
• 2.2.5 质粒构建37-38
• 2.2.6 GFP定位38-39
• 2.2.7 酵母功能研究39
• 2.2.8 植物过表达分析39-40
• 2.2.9 数据分析40
• 2.3 结果与分析40-51
• 2.3.1 SaHMA3基因的克隆及序列分析40-43
• 2.3.2 SaHMA3基因的表达水平43-45
• 2.3.3 SaHMA3的定位45-47
• 2.3.4 SaHMA3的酵母功能研究47-49
• 2.3.5 烟草过表达SaHMA3h后对镉、锌的耐性及积累分析49-51
• 2.4 讨论51-55
• 第三章 东南景天镉耐性与MT2基因功能的关系研究55-69
• 摘要55
• 3.1 引言55-57
• 3.2 材料及方法57-60
• 3.2.1 植物培养57
• 3.2.2 SaMT2基因的克隆及序列分析57
• 3.2.3 定量PCR分析57-58
• 3.2.4 载体构建58
• 3.2.5 酵母功能分析58-59
• 3.2.6 转基因烟草的构建及其金属耐性与积累分析59
• 3.2.7 SOD,POD,CAT和H_2O_2的测定59-60
• 3.2.8 数据分析60
• 3.3 结果与分析60-66
• 3.3.1 SaMT2基因的克隆及序列分析60-61
• 3.3.2 东南景天体内SaMT2基因的表达水平61-62
• 3.3.3 SaMT2的酵母功能互补分析62-64
• 3.3.4 转基因烟草的耐性与积累分析64-66
• 3.4 讨论66-69
• 第四章 东南景天镉积累与NRAMP家族基因的关系研究69-95
• 摘要69-70
• 4.1 引言70-71
• 4.2 材料与方法71-76
• 4.2.1 植物培养71
• 4.2.2 NRAMP家族基因的克隆71-73
• 4.2.3 NRAMP家族基因序列分析73
• 4.2.4 NRMMP家族基因的表达分析73-74
• 4.2.5 质粒构建74
• 4.2.6 GFP定位74-75
• 4.2.7 酵母功能研究75
• 4.2.8 植物过表达分析75-76
• 4.2.9 数据分析76
• 4.3 结果与分析76-91
• 4.3.1 东南景天NRAMP家族基因的序列分析76-79
• 4.3.2 东南景天NRAMP家族基因的表达量分析79-83
• 4.3.3 东南景天NRAMP蛋白的亚细胞定位分析83-84
• 4.3.4 东南景天NRAMP蛋白的酵母功能分析84-87
• 4.3.5 东南景天NRAMP家族基因在植物中的功能分析87-91
• 4.4 讨论91-95
• 第五章 综合讨论与研究展望95-97
• 5.1 综合讨论95-96
• 5.2 主要创新点96
• 5.3 研究展望96-97
• 参考文献97-117
• 攻读博士学位期间主要成果117-11

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本文编号：679822