大豆根瘤表面细菌多样性及其促植物生长和结瘤能力的研究

发布时间：2017-08-28 20:29

  本文关键词：大豆根瘤表面细菌多样性及其促植物生长和结瘤能力的研究

  更多相关文章： 大豆 根瘤 根际菌促生菌 互作 抑制差减杂交

【摘要】：大豆是一种重要的农作物,其与根瘤菌共生形成根瘤后能进行生物固氮,增加植物的营养供给,保持土壤肥力。大豆根际菌能促进大豆植株生长和结瘤,因此人们对大豆根际菌的研究越来越重视。但是,目前在大豆根际菌的研究中存在着一些缺陷,如：大部分研究将根际视为均一的整体,而忽视了根际不同区域间的差异；对于根际菌促进植株生长和结瘤的研究大多停留在表面,而缺乏对于相关机制的全面和深入的研究。针对这些缺陷,本研究选取了大豆根际中一个特殊的区域——根瘤表面作为研究对象,首先分析了该区域细菌群落的组成,进而选择了从该区域分离到的部分菌株进行促生长和促结瘤试验,试图探讨这些菌株促进生长和结瘤的机制,并尝试寻找这些菌株中与促进植株生长和结瘤有关的基因。在研究中,我们从大豆品种中黄13的根瘤表面共分离到92株细菌菌株。对这些菌株的16S rRNA基因进行了测序比对,并对他们可能具有的与促生相关的理化特性进行了检测。结果显示,在大豆根瘤表面分布的菌株分属4个门,Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria和Bacteroidetes的14个属。从门的水平来看,超过一半的菌株属于Proteobacteria,与之前报道的大豆和很多其他植物的根际菌群组成非常相似。从属的水平来看,有8个属,包括Pseudochrobactrum(占全部菌株的17.39%),Alcaligenes(18.48%)和Lysinibacillus(9.78%)等是没有在大豆的根际和根内被发现和报道过的,说明根瘤表面具有一些独特的机制来构建自己特有的菌群。从理化特性的角度分析,在根瘤表面菌群中具有产吲哚乙酸(IAA)能力的菌比例较大(71%),这一点与其他植物根际菌群比较相似。但其他三种理化特性的比例与其他植物根际菌群差异较大,其中产几丁质酶的菌(30%)和铁载体的菌(42%)比例较其他根际菌群高,而溶磷菌(8%)较低,这可能也与根瘤表面独特的环境条件有关。根据对根瘤表面细菌群落组成分析的结果,我们选择了其中的22株菌进行了植物接种试验。结果发现16株菌具有一定的促生长或促结瘤能力,其中5株,包括CCNWSP78, CCNWSP60, CCNWSP46, CCNWSP15和CCNWSP13-4促生长和结瘤能力比较强。这一结果表明,具有促生长和促结瘤能力的菌株在整个根瘤表面菌群中所占比例是比较高的,这可能是因为该区域离根瘤很近,关系较为密切。也说明根瘤表面菌群是筛选、获得促生菌的一个很好的来源。通过对植物试验结果进行统计分析,我们提出了促生菌对根瘤菌一大豆植株体系的影响方式可以分为三种类型：一是影响结瘤过程,提高根瘤数量,进而通过增加根系的营养供给,间接的影响根系,提高根系的生物量；二是促进植物根系生长,从而通过为根瘤提供更多的结瘤位点,提高结瘤数量；三是影响结瘤过程,但并不提高根瘤数量,而是增大单个根瘤的体积。从根际菌本身的理化特性来看,我们发现根际菌产铁载体的能力与其促进根系生长、增加根瘤数量及固氮量都有关系,而产几丁质酶的能力仅与根瘤数量和固氮量的增加有关。在植物试验中,我们发现产碱杆菌属(Alcaligenes)的两个菌株CCNWSP13-4和CCNWSP30亲缘关系非常接近,但促生长和促结瘤能力却相差甚远。我们通过抑制差减杂交技术试图寻找这两个菌株的差异基因。我们构建了由200多个克隆组成的差减基因文库,并对其中部分克隆进行了测序和同源性搜索,目前共获得11个差异基因片段,其中3个可能与DNA的修饰及转录有关,1个可能与糖代谢有关,剩余的7个则都是未知功能的基因。我们还对分离自大豆根瘤表面的两株细菌CCNWSP36-1和CCNWSP60采用多相分类的方法进行了鉴定。结果表明,这两株菌株与已有各种均有一定的差异,是两个新种。我们将其中CCNWSP36-1T所代表的新种命名为Sphingobacterium yanglingense,将CCNWSP60T所代表的新种命名为Microbacterium shaanxiense。据我们所知,这是国内外首次以大豆根瘤表面细菌群落为主要对象开展的研究。本研究取得了一些具有创新性的成果：首先,通过研究我们发现,在大豆中黄13的根瘤表面分布的细菌群体中,Proteobacteria是占优势,从这些根瘤表面细菌中,我们还鉴定了两个新种,Sphingobacterium yanglingense和Microbacterium shaanxiense;其次,通过研究,我们考察了这些根瘤表面细菌的促植物生长和结瘤的能力,筛选出几株促生长和结瘤能力较强,具有一定应用潜力的促生菌株,此外,通过统计分析,我们对这些促生菌的促植物生长和结瘤固氮的模式进行了探讨；最后,通过抑制差减杂交技术对促生能力有差异的两株产碱杆菌(Alcaligenes)的差异基因进行了比较和分析,建立了差减基因文库,为后续研究与促植物生长和促结瘤作用相关的功能基因提供了基础。本研究的结果对于深入认识根瘤表面细菌群落,分析豆科植物—根瘤菌—根际菌这一复杂的互作体系的运行方式提供了一定的指导和参考,也为进一步开发和利用根瘤菌—根际菌混合菌剂以提高大豆产量提供了理论基础。
【关键词】：大豆 根瘤 根际菌促生菌 互作 抑制差减杂交
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S565.1;S182
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 综述12-24
• 1.1 大豆和根瘤菌12-13
• 1.2 根际菌13-14
• 1.3 根际细菌群落的组成和结构14-17
• 1.3.1 土壤因素对根际细菌群落的影响14-15
• 1.3.2 植物因素对根际细菌群落的影响15-17
• 1.3.3 大豆根际菌群的组成17
• 1.4 根际细菌对植物的影响17-21
• 1.4.1 根际微生物对植物的有害影响17
• 1.4.2 根际微生物对植物的有利影响17-21
• 1.5 根际菌研究中存在的问题21-22
• 1.6 本研究的思路及意义22-24
• 第二章 大豆根瘤菌及根瘤表面细菌的分离和鉴定24-43
• 2.1 材料与方法24-30
• 2.1.1 采样24-25
• 2.1.2 菌株的分离及分类鉴定25-28
• 2.1.3 根瘤表面细菌菌株促生理化特性的测定28-30
• 2.2 结果与分析30-40
• 2.2.1 土壤样品的理化检测结果30
• 2.2.2 根瘤菌菌株的分离鉴定和促生理化特性的检测30-31
• 2.2.3 根瘤表面细菌菌株的分离鉴定和促生理化特性的检测31-40
• 2.3 讨论与结论40-43
• 第三章 根瘤表面细菌促大豆生长和促结瘤能力的研究43-71
• 3.1 材料与方法43-47
• 3.1.1 植物试验所用的菌株43-46
• 3.1.2 植物试验设计46
• 3.1.3 植物试验46-47
• 3.1.4 数据处理47
• 3.2 结果与分析47-66
• 3.3 讨论与结论66-71
• 第四章 产碱杆菌促进植物生长和结瘤差减基因文库的构建71-85
• 4.1 材料与方法72-79
• 4.1.1 试验所用菌株72-73
• 4.1.2 抑制差减杂交73-79
• 4.2 结果与分析79-83
• 4.2.1 基因组提取及酶切79
• 4.2.2 接头连接效率分析79-80
• 4.2.3 抑制差减杂交的结果80-81
• 4.2.4 差减效率的分析81
• 4.2.5 插入片段的PCR分析81-82
• 4.2.6 序列测定、检验和同源性分析82-83
• 4.3 讨论与结论83-85
• 第五章 两株根瘤表面细菌新种的鉴定85-106
• 5.1 材料与方法85-90
• 5.1.1 试验所用菌株85
• 5.1.2 形态特征和培养特征85-86
• 5.1.3 微生物的生理特征86
• 5.1.4 微生物细胞的化学组成86-88
• 5.1.5 遗传物质88-90
• 5.2 结果与分析90-105
• 5.2.1 对菌株CCNWSP36-1的鉴定结果90-97
• 5.2.2 对菌株CCNWSP60的鉴定结果97-105
• 5.3 讨论与结论105-106
• 总结和展望106-109
• 参考文献109-120
• 附录120-129
• 缩略词129-130
• 致谢130-131
• 作者简介131

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 关龙峰;于德海;;不同品种应用大豆根瘤菌肥试验效果分析[J];黑龙江科技信息;2008年30期

，

本文编号：749311