多元质粒工程技术及CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的建立与应用

发布时间：2017-08-31 12:37

  本文关键词：多元质粒工程技术及CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的建立与应用

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【摘要】：构建具有最优功能的合成代谢途径是代谢工程及合成生物学面临的一个主要挑战。本文首先建立了多元质粒工程(Multiplex Iterative Plasmid Engineering,MIPE)技术,可以高效的对构建在质粒上的代谢途径进行组合优化。MIPE技术利用多元ssDNA重组向质粒中引入突变点,对质粒上的多个靶向位点进行组合修饰,通过一个反应能够构建107的质粒文库。同时,利用质粒DNA和ssDNA共转策略及限制性酶切介导的共筛选(Restriction Digestion mediated Co-Selection,RD CoS)策略提高了质粒ssDNA重组的效率进而提高了MIPE引入组合突变的能力。作为对MIPE的测试,我们首先利用MIPE优化含有5个基因的核黄素代谢途径,在一周时间内将核黄素产量提高了2.67倍。之后,我们利用MIPE同时靶向750 bp的红色荧光蛋白的23个密码子,在文库中实现了31%的密码子的平均突变率。之后,我们基于CRISPR-Cas9在大肠杆菌中建立一个快速、高效、可循环的基因组编辑系统,从而为在基因组上快速、便捷的优化代谢途径提供了一个有价值的工具。这项技术能够以接近100%的编辑效率进行基因敲除和插入等多种遗传操作,并且能够同时插入三个突变点。我们还建立了基于CRISPR-Cas9的可诱导的质粒消除系统,能够将gRNA质粒从细胞中消除,从而实现循环的基因组编辑,每个循环仅需两天。同时,我们发现使用有功能性的错配修复系统(mismatch repair,MMR)的野生菌株可以显著的降低细胞逃脱CRISPR切割的概率,进而提高基因组编辑效率。为了测试这项技术在代谢工程中的应用潜力,我们利用它将β-胡萝卜素合成代谢途径整合到了大肠杆菌基因组上,并且对甲基赤藓糖醇4-磷酸(methylerythritol 4-phosphate,MEP)代谢途径和中心碳代谢途径进行组合优化提高β-胡萝卜素产量。我们一共测试了33个基因组操作,构建了超过100个不同的菌株,其中最优菌株含有15个基因组修饰,通过分批发酵可以生产2.0 g/L的β-胡萝卜素。
【关键词】：合成代谢途径 组合优化 重组工程 基因组工程 CRISPR-Cas9 β-胡萝卜素
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 中文摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文献综述10-37
• 1.1 合成代谢途径的组合优化10-17
• 1.1.1 质粒上合成代谢途径的构建及优化策略11-15
• 1.1.2 多元模块工程策略15-16
• 1.1.3 基因组上的组合优化方法16-17
• 1.2 λ Red重组工程和多元重组技术17-27
• 1.2.1 λ Red重组系统的结构及原理18
• 1.2.2 dsDNA介导的 λ Red重组18-20
• 1.2.3 ssDNA介导的 λ Red重组20-22
• 1.2.4 MAGE技术的原理、优化及应用22-26
• 1.2.5 TRMR技术的原理与应用26-27
• 1.3 基因组编辑技术27-31
• 1.3.1 常用的基因组编辑方法简介27-28
• 1.3.2 CRISPR-Cas基因组编辑技术28-31
• 1.4 萜类化合物及 β-胡萝卜素的简介及生物合成31-34
• 1.4.1 萜类化合物简介31-32
• 1.4.2 β-胡萝卜素简介32
• 1.4.3 萜类化合物的生物合成32-34
• 1.5 选题背景及技术路线34-37
• 1.5.1 多元质粒工程技术的建立与应用34-35
• 1.5.2 基于CRISPR-Cas9的大肠杆菌基因组编辑技术的建立与应用35-37
• 第二章 多元质粒工程技术的建立和应用37-70
• 2.1 实验材料37-41
• 2.2 实验方法41-52
• 2.3 实验结果与讨论52-68
• 2.3.1 MIPE技术的建立与优化52-56
• 2.3.2 利用MIPE技术优化核黄素代谢途径56-62
• 2.3.3 利用MIPE技术对红色荧光蛋白进行组合突变62-68
• 2.4 本章小结68-70
• 第三章 大肠杆菌中CRISPR-CAS9介导的基因组编辑技术的建立70-86
• 3.1 实验材料70-71
• 3.2 实验方法71-73
• 3.3 实验结果与讨论73-84
• 3.3.1 CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术原理73-74
• 3.3.2 测试菌株的构建74-76
• 3.3.3 gRNA质粒的构建策略76-78
• 3.3.4 质粒消除系统和p Cas9cur质粒的构建78-83
• 3.3.5 利用CRISPR-Cas9系统实现高效的连续的基因组编辑83-84
• 3.4 本章小结84-86
• 第四章 CRISPR-CAS9介导的基因组编辑的表征与优化86-104
• 4.1 实验材料86-87
• 4.2 实验方法87
• 4.3 实验结果与讨论87-102
• 4.3.1 供体DNA浓度对编辑效率的影响87-88
• 4.3.2 供体DNA同源臂长度对编辑效率的影响88-90
• 4.3.3 基因敲除和密码子替换的效率90-92
• 4.3.4 基因插入的效率92-93
• 4.3.5 同时对多个位点进行编辑的效率93-94
• 4.3.6 CRISPR-Cas9介导的DSB对重组效率的影响94-96
• 4.3.7 MMR对假阳性菌落数量的影响96-97
• 4.3.8 MMR对基因组编辑效率的影响97-98
• 4.3.9 MMR对CRISPR-Cas9系统引入的突变点的修复98-100
• 4.3.10 λ Red系统、recA基因和recET基因对重组效率的影响100
• 4.3.11 本实验开发的CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的特点100-102
• 4.4 本章小结102-104
• 第五章 利用CRISPR-CAS9介导的基因组编辑进行代谢工程104-128
• 5.1 实验材料104
• 5.2 实验方法104-106
• 5.3 实验结果与讨论106-126
• 5.3.1 在基因组中构建 β-胡萝卜素合成代谢途径106-108
• 5.3.2 优化MEP代谢途径提高 β-胡萝卜素产量108-112
• 5.3.3 优化中心碳代谢途径提高 β-胡萝卜素产量112-116
• 5.3.4 上游和下游代谢途径的组合优化116-126
• 5.4 本章小结126-128
• 第六章 结论与展望128-131
• 6.1 主要结论128-129
• 6.2 主要创新点129
• 6.3 展望129-131
• 参考文献131-142
• 发表论文及参加科研情况说明142-143
• 附录143-145
• 致谢145-146

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1 朱金洁;CRISPR-Cas9介导的玉米基因组定点编辑研究[D];中国农业大学;2015年

2 李一凡;多元质粒工程技术及CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的建立与应用[D];天津大学;2015年

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本文编号：765645