转录因子TDF1对拟南芥绒毡层以及花粉壁发育的转录调控研究

发布时间：2017-08-31 18:10

  本文关键词：转录因子TDF1对拟南芥绒毡层以及花粉壁发育的转录调控研究

  更多相关文章： TDF1 AMS SKS18 EXPB5 TEK MS188 绒毡层 花粉壁发育 转录调控 雄性不育

【摘要】：高等植物的整个生命周期可分为孢子体营养发育过程以及配子体生殖发育过程。在雄性生殖发育中,孢子体绒毡层对于花粉以及花粉壁的发育起到至关重要的作用:为小孢子提供必需的营养,降解胼胝质使小孢子从四分体中释放,提供转运孢粉素前体构成花粉外壁结构,启动细胞凋亡程序等。Defective in tapetal development and function 1(TDF1)编码一个R2R3 MYB家族的转录因子,其在花药发育早期的绒毡层和小孢子中均有特异表达,为绒毡层早期的发育及功能起到重要的作用。然而,TDF1及其下游调控基因组成的转录调控通路,以及TDF1在绒毡层和花粉发育过程中所涉及到的具体生物学途径仍有待深入研究。在本文中,通过获得TDF1融合GFP/MYC/FLAG/HA各标签蛋白的互补转基因株系,利用染色质免疫共沉淀(Ch IP)和凝胶迁移滞后实验(EMSA)体内/体外证明TDF1可以直接结合于AMS启动子的AACCT结合位点上。此外,烟草瞬时表达系统证明TDF1可以直接调控AMS表达。然而,Rescue实验获得tdf1/tdf1突变体背景的Pro DYT1:AMS转基因株系表明即使AMS能够正常表达,仍不能恢复tdf1的突变表型。由此,我们利用烟草叶片表达TDF1与AMS蛋白进行免疫共沉淀,结果表明TDF1与AMS蛋白能够相互作用,而这种互作方式有可能对激活AMS的下游靶基因起到关键作用。基因芯片分析表明TDF1调控的基因主要参与到各类酶家族、细胞壁合成和细胞发育的途径中,这提示了TDF1与绒毡层细胞分化/细胞壁修饰/细胞发育的生物学过程有着密切联系。因此,结合tdf1绒毡层细胞分裂增多、空泡化严重的表型,我们发现TDF1还可以直接调控SKS11、SKS13、SKS18、EXPB5基因,从而抑制细胞分裂、促进细胞壁扩大来满足绒毡层快速的转入分泌型。SKS18基因特异在花药发育第6~7期的绒毡层中表达。SKS18-GFP则在第6~7期特异定位在绒毡层的细胞壁/细胞膜上,之后则逐渐迁移至小孢子膜上和药室腔里。另一方面,我们体内/体外证明AMS可以直接调控MS188和TEK的表达,从而调控花粉外壁外层与外壁内层的发育。此外,我们通过对Pro AMS:TEK:GFP和Pro AMS:MS188:GFP转基因株系的观察,表明提前表达TEK和MS188均会对野生型背景的花粉壁发育造成严重影响,从而导致花粉完全败育。由此,进一步表明花粉壁发育时序的重要性。基于以上结果,本文阐明了转录因子TDF1及其下游转录调控网络对绒毡层分化以及花粉壁发育所起到的生物学作用。
【关键词】：TDF1 AMS SKS18 EXPB5 TEK MS188 绒毡层 花粉壁发育 转录调控 雄性不育
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 1. 前言10-27
• 1.1. 绒毡层发育与功能10-23
• 1.1.1. 花药发育10-13
• 1.1.2. 绒毡层发育13-14
• 1.1.3. 绒毡层功能14-23
• 1.2. 绒毡层转录调控网络23-27
• 1.2.1. 绒毡层细胞形成的转录调控23-24
• 1.2.2. 绒毡层细胞发育的转录调控24-27
• 2. 材料与方法27-48
• 2.1. 实验材料27-29
• 2.1.1. 植物材料、菌株与质粒27-28
• 2.1.2. 试剂与仪器28-29
• 2.2 实验方法29-46
• 2.2.1. 拟南芥种植29
• 2.2.2. 半薄切片观察29-30
• 2.2.3. 透射电镜观察30-31
• 2.2.4. 分子克隆与构建31-35
• 2.2.5. 拟南芥转化35
• 2.2.6. 拟南芥转基因植株的筛选35-36
• 2.2.7. RNA的抽提及反转录36
• 2.2.8. 定量PCR分析36-37
• 2.2.9. 原位杂交37-38
• 2.2.10.染色质免疫共沉淀38-40
• 2.2.11.植物总蛋白的提取40-41
• 2.2.12. Western Blot检测41-42
• 2.2.13.原核表达与蛋白纯化42-43
• 2.2.14.凝胶阻滞实验43-44
• 2.2.15.烟草叶片瞬时表达蛋白及免疫沉淀44-46
• 2.3. 实验引物列表46-48
• 3. 实验结果48-75
• 3.1. TDF1 标签互补转基因株系的构建与鉴定48-51
• 3.2. TDF1 直接调控AMS基因的表达51-54
• 3.3. 在tdf1 突变体中表达AMS基因不能够恢复绒毡层空泡化及肿胀表型54-55
• 3.4. TDF1 与 AMS 蛋白的相互作用55-58
• 3.5. TDF1 主要调控了与各类酶家族、细胞壁合成和细胞发育的相关基因58-62
• 3.6. TDF1 直接调控 SKS11、SKS13、SKS18、EXPB5 基因的表达62-66
• 3.7. SKS18 基因的表达及功能分析66-67
• 3.8. AMS直接调控TEK和MS188 基因的表达67-69
• 3.9. ProAMS:TEK-GFP转基因植株细胞学观察69-72
• 3.10.ProAMS:MS188-GFP转基因植株细胞学观察72-75
• 4. 讨论75-83
• 4.1. TDF1 直接调控AMS基因发挥绒毡层对花粉壁发育的作用75-77
• 4.2. TDF1 直接调控SKS18、EXPB5 基因发挥分泌型绒毡层的作用77-79
• 4.3. 绒毡层与花粉壁发育的转录调控网络79-83
• 参考文献83-96
• 发表文章目录96-97
• 致谢9

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本文编号：767107