血管内皮前体细胞对骨髓间充质干细胞干性功能的影响

发布时间：2017-09-06 09:34

  本文关键词：血管内皮前体细胞对骨髓间充质干细胞干性功能的影响

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【摘要】：目的：通过体内及体外实验验证EPCs对MSCs自我更新能力的影响,进而说明EPCs可能是MSCs干细胞巢细胞。 方法：体外C57BL/6J(野生型)小鼠骨髓腔分离及鉴定EPCs和MSCs,使用GFP标记MSC, PKH26标记EPCs。在6孔板内均匀的种植MSCs细胞和滋养细胞,使用克隆形成实验,观察不同条件下观察克隆形成数量。细胞来源有：正常培养的MSCs和与EPCs共培养的MSCs两种情况；同时使用克隆柱法取取5个大小及形态相似的克隆体,分单纯克隆MSC细胞、与EPCs联合、使用PBS联合(对照组)三种情况,通过骨髓回植的方法,注射到Rag2-/-鼠的骨髓腔内,4周后,流式细胞分离技术提取鼠外周血中的GFP阳性的MSCs,再进行克隆形成实验(Secondary CFU-F),观察克隆体的数目；同时取鼠的肝脏和肺脏,冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP标记的阳性MSCs的分布及表达情况,体内进,步验证EPCs对MSCs的自我更新能力的影响。 结果：成功从C57BL/6J鼠骨髓腔分离了MSCs和EPCs, MSCs经成成脂分化、成软骨分化、成骨分化鉴定成功；EPCs经血管形成实验(Tube formation)鉴定成功。GFP成功标记了MSCs, PKH26成功标记了EPCs。体外培养发现,与EPCs共培养后的MSCs的克隆体数目CFU-Fs比单纯的MSCs的克隆体要多(P0.05)。体内实验发现,骨髓注射了与EPCs和MSCs的鼠外周血MSCs的克隆体(Secondary CFU-Fs)比单纯注射了MSCs的鼠外周血MSCs的Secondary CFU-Fs要多。解剖小鼠,取鼠的肺脏及肝脏,行冰冻切片,荧光倒置显微镜观察发现,骨髓注射了MSCs和EPCs后的鼠肺脏和肝脏的GFP标记的阳性MSCs的数量要比单纯注射了MSCs的鼠的表达多(P0.05)。 结论：在体内及体外,EPCs均能调控MSCs的自我更新,很可能是MSCs干细胞巢细胞组成之一。 目的：探讨纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)及其下游受体整合素α5β1在在干细胞巢内粘附过程中的作用。 方法：通过第一部分中的方法,获得,使用ELISA方法检测二者的培养基中FN的表达情况,使用免疫荧光的方法观察FN在细胞内的表达情况；细胞粘附实验观察将MSCs与EPCs体外粘附显现：使用FN-siRNA干扰MSCs与EPCs中FN的表达,进 一步观察粘附现象。使用MSCs和EPCs的无血清及无因子的空白培养基分别刺激对方细胞,使用Realtime-PCR和Westernbloting检测二者FN及其下游受体的表达情况。 结果：MSCs与EPCs的培养基中均表达FN,后者比前者表达量要多(P0.05)；免疫荧光观察FN在二者中均有表达,主要分布在细胞浆及细胞膜上,二者在体外共培养体系中发生粘附。成功使用FN-siRNA干扰MSCs与EPCs中FN的表达,使其表达下调,观察二者粘附显著下降,甚至不粘附。RT-PCR结果显示,EPCs的无血清及无因子的空白培养基可使MSCs细胞内的α5β1表达上调；MSCs的无血清及无因子的空白培养基可使EPCs细胞内的FN表达上调。 结论：EPCs可通过旁分泌FN与其下游的整合素α5β1受体作用,介导MSCs与EPCs的巢内粘附,从而锚固MSCs。 目的：初步探讨Wnt/β-catenin通路在EPCs促进MSCs自我更新中的作用研究。 方法：在体外进行克隆形成实验(CFU-F),观察加入培养过EPCs细胞的培养基对克隆形成数量的影响：使用Wnt/β-catenin通路的抑制剂XAV939干预克隆形成的培养基,观察克隆形成数量：使用RT-PCR和Western-blot方法检测过EPCs细胞的培养基对MSCs的胞内β-catenin因子mRNA和蛋白的表达影响,以此浅探EPCs对MSCs自我更新的影响及其可能机制。 结果：加入培养过EPCs细胞的培养基的形成克隆数量要多于正常克隆形成培养的克隆数(P0.05)；使用Wnt/β-catenin通路的抑制剂XAV939的克隆形成数明显下降；RT-PCR结果提示EPCs可上调MSCs β-catenin因子mRNA的表达(P0.05)；Western-blot结果提示EPCs可上调MSCs胞内β-catenin因子蛋白的表达。 结论：Wnt/β-catenin通路参与了EPCs促进MSCs自我更新的过程。
【关键词】：间充质干细胞 血管内皮前体细胞 自我更新 干细胞巢 调控 内皮前体细胞 间充质干细胞 粘附 干细胞巢 纤维粘连蛋白 整合素 间充质干细胞 内皮前体细胞 自我更新 Wnt/β-catenin通路 XAV939
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 前言7-18
• 参考文献13-18
• 第一部分：血管内皮前体细胞可能是间充质干细胞巢细胞的证据研究18-39
• 中文摘要18-19
• 英文摘要19-20
• 引言20-21
• 实验材料21-22
• 实验方法22-25
• 统计学方法25-26
• 实验结果26-34
• 讨论34-36
• 参考文献36-39
• 第二部分：FN-整合素α5β1介导MSCs和EPCs粘附机制研究39-65
• 中文摘要39-40
• 英文摘要40-41
• 引言41-42
• 实验材料42-45
• 实验方法45-51
• 统计学方法51-52
• 实验结果52-60
• 讨论60-63
• 参考文献63-65
• 第三部分：Wnts信号通路在EPCs调控MSCs自我更新中的作用65-82
• 中文摘要65-66
• 英文摘要66-67
• 引言67-68
• 实验材料68-70
• 实验方法70-75
• 实验结果75-77
• 讨论77-79
• 参考文献79-82
• 文献综述82-107
• 参考文献95-107
• 附录一：英文缩略词107-109
• 附录二：发表文章109-110
• 致谢110-111

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本文编号：802351