鸭产蛋下降相关新病毒的分子鉴定与生物学特性研究

发布时间：2017-09-06 16:19

  本文关键词：鸭产蛋下降相关新病毒的分子鉴定与生物学特性研究

  更多相关文章： 微RNA病毒 Aalivirus 小双节RNA病毒 Dusavirus 鸭星状病毒

【摘要】：近20年来,鸭新发病毒性疾病不断出现,严重制约了我国养鸭业的健康稳定发展。因此,开展鸭未知新病毒的探索研究日趋重要。 从广东的6个发病蛋鸭群和4个康复蛋鸭群以及广西的1个发病肉种鸭群和1个发病商品鸭场采集样品,共计107份,针对坦布苏病毒、布尼亚病毒、甲病毒、杯状病毒、禽博尔纳病毒(Avian bornavirus, AB V)、禽星状病毒和微RNA病毒进行了PCR检测。从1份肉种鸭粪样和2份商品肉鸭肠道样品中检出微RNA病毒；因ABV引物错配,从1份蛋鸭粪样中检出小双节RNA病毒。对扩增产物进行测序和序列分析的结果表明,鸭源微RNA病毒和鸭源小双节RNA病毒(Duck picorbirnavirus, DuPBV)可能属于2种新的病毒。 选GL/12株,用RT-PCR和5'/3'RACE技术测定了鸭源微RNA病毒的基因组序列。序列分析表明,GL/12株拥有微RNA病毒的基因组结构,但亦有其自身的特点。该病毒的2A区编码6种2A蛋白基序,包括4个含NPGP基序的2A(2A1-2A4)、1个AIG1.样的2A5以及1个双埃柯病毒样的2A6；其5'UTR含有丙肝病毒/瘟病毒(Hepacivirus/pestivirus, HP)样内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site, IRES)。但是,该IRES的IIIe亚域由3-nt的茎和5-nt的环组成,与以往报道的HP样IRES均有所不同。在P1、P2和P3区,GL/12株与鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)的氨基酸序列同源性最高,分别为37.7%、39%和43.7%。进化分析结果表明,GL/12株与DHAV和Avisivirus A (AsV-A)具有相近的遗传演化关系,但变异性亦十分明显。因此,将GL/12株鉴定为微RNA病毒科一个新属的成员,暂将其属名称为Aalivirus,以Aalivirus A (AalV-A)作为代表种。 以广东15个蛋鸭群的142份样品为材料,用PBV特异性RT-PCR进行了检测,从70份(49.3%)样品中检出DuPBV,表明DuPBV在蛋鸭中的感染较为普遍。对所测定的264条RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)序列进行进化分析的结果显示,这些序列均属PBV基因I群,其氨基酸同源性为56%--100%,表现出高度变异性。选DuPBV4-17株,用RT-PCR和5'RACE技术测定了基因组序列。序列分析表明,DuPBV4-17株基因组由两个片段构成,分别编码衣壳蛋白和RdRp,符合PBV基因组结构特点。同源性分析和进化分析的结果表明,DuPBV4-17株与以往报道的PBV存在较大的序列变异性。在测定另外一株DuPBV(4-23株)的基因组序列时,意外检出Posavirus样病毒的基因序列,以此为基础,测定了Posavirus样病毒4-23株约78%的基因组序列。分析结果显示,4-23株具有微RNA病毒目的基因组结构特点。与Posavirus和Fisavirus类似,其非结构蛋白和衣壳蛋白编码区分别位于基因组的5'和3'部分。用微RNA病毒目3CD和衣壳蛋白序列进行进化分析的结果显示,4-23株与Posavirus和Fisavirus具有相近的遗传演化关系,但又表现出明显的差异。建议在微RNA病毒目中为Posavirus和Fisavirus成立一个新的病毒科,且4-23株属于该科中的一个新病毒属的成员。暂将病毒属名称为Dusavirus,以Dusavirus A (DuV-A)作为其代表种。 2013年8月,在我国东北某金定麻鸭养殖区,出现一种疑似鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)的传染病,该病可导致1-6周龄雏麻鸭和12周龄以上成年麻鸭发病和死亡,并可导致成年鸭产蛋下降。病鸭表现出DVH的特征临床症状和病理变化,在成年鸭的卵巢,见有出血病变。组织病理学观察显示,病鸭各内脏组织均有不同程度的出血、坏死和淋巴细胞浸润。针对不同病原进行分子检测的结果显示,鸭星状病毒1型(Duck astrovirus1, DAstV-1)可能是致病病原。免疫组化试验和组织分布检测结果显示,DAstV-1可侵害多种不同的器官。用DAstV-1进行实验感染试验,可在雏北京鸭、雏麻鸭和成年麻鸭中复制出DVH。基因组测序和序列分析结果显示,来自不同日龄的4株DAstV-1与以往报道的DAstV-1参考毒株C-NGB株具有相近的遗传演化关系(氨基酸同源性为98-99%)。综上所述,DAstV-1可导致成年鸭发生DVH。 基因组序列比较分析表明,相对于C-NGB株,所测4株DAstV-1的基因组存在18个氨基酸位点的共同突变,提示这些位点可能与DAstV-1对成年鸭的致病性有关,因此,本研究以DAstV-1D17株为亲本毒,构建了覆盖基因组全长的cDNA克隆。用体外转录的RNA转染BHK-21,随后将细胞培养物接种LMH细胞并进行传代培养。用荧光抗体对第3代LMH细胞培养物进行检测的结果显示,DAstV-1蛋白在细胞中获得了表达。据此可认为,病毒获得了拯救。此结果为今后进一步研究DAstV-1基因功能以及致病机理提供了良好的技术手段。
【关键词】：微RNA病毒 Aalivirus 小双节RNA病毒 Dusavirus 鸭星状病毒
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 目录7-12
• 第一章 文献综述12-27
• 1.1 微RNA病毒12-15
• 1.1.1 病毒分类12
• 1.1.2 基因组结构12-13
• 1.1.3 2A蛋白13-14
• 1.1.4 内部核糖体进入位点14
• 1.1.5 禽类微RNA病毒14-15
• 1.2 小双节RNA病毒15-19
• 1.2.1 病毒发现的历史概述15-16
• 1.2.2 PBV的分类16-17
• 1.2.3 PBV的基因组结构17
• 1.2.4 PBV的基因分型17-18
• 1.2.5 PBV的致病性18-19
• 1.3 Posavirus及相关病毒19-20
• 1.3.1 Posavirus19-20
• 1.3.2 Fisavirus20
• 1.4 星状病毒20-24
• 1.4.1 病毒发现的历史概述20-21
• 1.4.2 病毒分类21-22
• 1.4.3 星状病毒的基因组结构22
• 1.4.4 星状病毒对禽类的致病性22-23
• 1.4.5 星状病毒的诊断技术23-24
• 1.4.6 星状病毒的反向遗传操作技术24
• 1.5 近20年来鸭新发病毒病的流行概况24-25
• 1.6 研究目的和意义25-27
• 第二章 鸭源新病毒的分子检测27-39
• 摘要27
• 2.1 前言27
• 2.2 材料27-29
• 2.2.1 临床样品27-28
• 2.2.2 主要试剂盒试剂盒28
• 2.2.3 主要试剂配制28-29
• 2.2.4 主要仪器设备29
• 2.3 方法29-32
• 2.3.1 样品处理29
• 2.3.2 RNA提取29-31
• 2.3.3 RT-PCR31
• 2.3.4 PCR产物的回收和克隆31
• 2.3.5 PCR鉴定和测序31
• 2.3.6 序列分析31-32
• 2.4 结果32-37
• 2.4.1 RT-PCR检测32-33
• 2.4.2 PCR扩增产物测序与序列分析33
• 2.4.3 鸭源PBV的序列分析33
• 2.4.4 鸭源微RNA病毒的序列分析33-37
• 2.5 讨论37-38
• 2.5.1 关于样品来源和所选检测方法37-38
• 2.5.2 关于鸭源新病毒38
• 2.6 小结38-39
• 第三章 鸭源新微RNA病毒的分子鉴定39-58
• 摘要39
• 3.1 前言39-40
• 3.2 材料40
• 3.2.1 临床样品40
• 3.2.2 鸭胚和SPF鸡胚40
• 3.2.3 主要试剂、试剂盒和仪器设备40
• 3.3 方法40-43
• 3.3.1 病毒分离40
• 3.3.2 基因组测序40-42
• 3.3.3 序列分析42-43
• 3.4 结果43-55
• 3.4.1 病毒培养43
• 3.4.2 基因组测序43-44
• 3.4.3 基因组结构分析44
• 3.4.4 同源性分析和进化分析44-50
• 3.4.5 聚蛋白裂解位点预测50-51
• 3.4.6 蛋白质基序分析51-53
• 3.4.7 IRES二级结构预测53-55
• 3.4.8 3'UTR二级结构预测55
• 3.5 讨论55-57
• 3.5.1 鸭源微RNA病毒的基因组结构特点55-56
• 3.5.2 鸭源微RNA病毒非编码区的二级结构56-57
• 3.5.3 鸭源微RNA病毒的分类地位57
• 3.6 小结57-58
• 第四章 鸭源小双节RNA病毒的分子检测与鉴定58-72
• 摘要58
• 4.1 前言58
• 4.2 材料58-59
• 4.2.1 临床样品58-59
• 4.2.2 鸭胚59
• 4.2.3 主要试剂、试剂盒和仪器设备59
• 4.3 方法59-62
• 4.3.1 样品处理和RNA提取59
• 4.3.2 RT-PCR检测59
• 4.3.3 病毒分离和培养59-61
• 4.3.4 DuPBV 4-17株基因组测序61-62
• 4.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)62
• 4.3.6 序列分析62
• 4.4 结果62-68
• 4.4.1 分子检测63-65
• 4.4.2 DuPBV的变异性分析65
• 4.4.3 病毒培养65
• 4.4.4 SDS-PAGE65
• 4.4.5 基因组测序65-67
• 4.4.6 基因组结构分析67-68
• 4.4.7 衣壳蛋白和RNA聚合酶的同源性分析和进化分析68
• 4.5 讨论68-71
• 4.5.1 DuPBV的基因组结构68
• 4.5.2 DuPBV的分类68-70
• 4.5.3 蛋鸭群中DuPBV的感染和变异70-71
• 4.5.4 关于Posavirus样病毒的发现71
• 4.6 小结71-72
• 第五章 鸭源Posavirus样病毒的分子鉴定72-80
• 摘要72
• 5.1 前言72
• 5.2 材料72-73
• 5.2.1 毒株72
• 5.2.2 鸭胚72-73
• 5.2.3 主要试剂、试剂盒和仪器设备73
• 5.3 方法73-74
• 5.3.1 病毒分离73
• 5.3.2 基因组测序73-74
• 5.3.3 序列分析74
• 5.4 结果74-77
• 5.4.1 病毒分离75
• 5.4.2 基因组测序75
• 5.4.3 基因组结构分析75-77
• 5.4.4 同源性分析和进化分析77
• 5.5 讨论77-79
• 5.5.1 鸭源Posavirus样病毒4-23株的基因组结构特点77-79
• 5.5.2 鸭源Posavirus样病毒4-23株的分类地位79
• 5.6 小结79-80
• 第六章 导致成年麻鸭发生DVH的DAstV-1的生物学特性研究80-112
• 摘要80
• 6.1 前言80-81
• 6.2 材料81-82
• 6.2.1 临床样品81-82
• 6.2.2 血清、细胞、SPF鸡胚、鸭胚和实验动物82
• 6.2.3 主要试剂和试剂盒82
• 6.3 方法82-89
• 6.3.1 核酸提取84
• 6.3.2 反转录84
• 6.3.3 PCR84
• 6.3.4 PCR产物的回收84
• 6.3.5 连接和转化84-85
• 6.3.6 PCR鉴定及测序85-86
• 6.3.7 基因组序列测定86
• 6.3.8 序列分析86
• 6.3.9 病毒的分离和培养86-87
• 6.3.10 自然病例的组织病理学检查87
• 6.3.11 免疫组织化学试验87-88
• 6.3.12 感染鸭群排毒期的监测88
• 6.3.13 组织分布检测88
• 6.3.14 感染试验88-89
• 6.4 结果89-107
• 6.4.1 流行病学特点和临床症状89-90
• 6.4.2 自然病例的大体病变90
• 6.4.3 自然病例的组织病理学变化90-97
• 6.4.4 病原的分子鉴定97-99
• 6.4.5 病毒的分离和培养99-101
• 6.4.6 自然病例的免疫组织化学101-102
• 6.4.7 DAstV-1排毒期的监测102
• 6.4.8 致病性试验102-104
• 6.4.9 DAstV-1的组织分布检测104-105
• 6.4.10 DAstV-1基因组结构和序列分析105-107
• 6.5 讨论107-111
• 6.5.1 关于DAstV-1所引起的DVH107-108
• 6.5.2 关于病原的分离和鉴定108-110
• 6.5.3 关于DAstV-1的感染和传播途径110-111
• 6.6 小结111-112
• 第七章 DAstV-1的反向遗传操作技术初探112-120
• 摘要112
• 7.1 前言112
• 7.2 材料112-113
• 7.2.1 病毒、细胞、载体和血清112
• 7.2.2 主要试剂和试剂盒112-113
• 7.3 方法113-117
• 7.3.1 基因组分段扩增113-114
• 7.3.2 中间质粒的构建114
• 7.3.3 中间质粒的同义突变114
• 7.3.4 DAstV-1 D17株全长质粒的连接114-115
• 7.3.5 DAstV-1 D17株全长质粒的测序115
• 7.3.6 全长质粒的线化和纯化115
• 7.3.7 体外转录与RNA纯化115-116
• 7.3.8 细胞转染116
• 7.3.9 免疫荧光检测和RT-PCR检测116-117
• 7.4 结果117-119
• 7.4.1 DAstV-1 D17株全基因组的扩增117
• 7.4.2 全长质粒pWSK-D17的酶切鉴定117-118
• 7.4.3 pWSK-D17的测序结果118
• 7.4.4 免疫荧光检测结果118
• 7.4.5 DAstV-1 RT-PCR检测结果118-119
• 7.5 讨论119
• 7.5.1 DAstV-1感染性克隆的构建119
• 7.5.2 关于DAstV-1拯救病毒的繁殖119
• 7.6 小结119-120
• 第八章 结论120-121
• 第九章 创新点121-122
• 参考文献122-140
• 致谢140-142
• 个人简介142

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 傅光华;程龙飞;施少华;彭春香;陈红梅;黄瑜;;鸭圆环病毒全基因组克隆与序列分析[J];病毒学报;2008年02期

2 刘鸿;陆新浩;任祖伊;朱梦代;黄建勇;吴勇;杨民;;番鸭“新肝病”在浙江的流行情况及防控措施[J];浙江畜牧兽医;2010年06期

3 胡奇林,陈少莺,江斌,程晓霞,林天龙,李怡英,程由铨;一种新的番鸭疫病(暂名番鸭肝白点病)病原的发现[J];福建畜牧兽医;2000年06期

4 程由铨,胡奇林,陈少莺,程晓霞,李怡英,林天龙;番鸭花肝病(暂定名)活疫苗的研究[J];福建畜牧兽医;2001年06期

5 吴宝成,陈家祥,姚金水,陈枝华,陈文列,李国平,曾显成;番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J];福建农业大学学报;2001年02期

6 张毓金,吕殿红,黄庚明,黄忠,廖丽春;番鸭花肝病高免卵黄抗体的试验初报[J];广东畜牧兽医科技;2000年01期

7 潘梦;付余;王笑言;徐永亮;杨汉春;张大丙;;国内新型鸭肝炎病毒基因组3′末端的序列特点[J];中国农业大学学报;2008年04期

8 王永坤;鸭流感防制研究进展[J];中国禽业导刊;2003年17期

9 仇保丰;刘武杰;彭大新;胡顺林;刘秀梵;;近年来华东地区家鸭中禽流感病毒的亚型分布[J];微生物学报;2008年10期

10 ;PCR Detection and Sequence Analysis of Duck Circovirus in Sick Muscovy Ducks[J];Virologica Sinica;2008年04期

，

本文编号：804155