犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析

发布时间：2017-09-06 16:44

  本文关键词：犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析

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【摘要】：犬瘟热(Canine Distemper,CD)是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。犬细小病毒性肠炎是由犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)引起的以肠炎、腹泻与主的烈性传染病。为了更好的控制与预防上述两种疫病的流行,本研究开展了犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析。首先,本研究以CDV3的RNA为模板,原核表达纯化了带His标签的N蛋白截短片段(aa277-471),免疫BALB/c雌鼠后,将其B淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过包被N蛋白截短片段(aa277-471)的ELISA筛选,获得分泌抗CDV的单克隆抗体杂交瘤阳性细胞1株,命名为1N8,亚类鉴定为Ig G1a,kappa链,该单克隆抗体间接免疫荧光检测阳性、WB检测阳性。接下来采用噬菌体展示和肽扫描的方法,筛选1N8结合的抗原表位:合成N蛋白(aa277-471)的15肽文库,每条多肽长度15aa,位移5aa,通过结合和筛选,得到一条与单克隆抗体1N8阳性反应的多肽,通过多肽N端和C端的不断缩减,最终证明该抗原表位的最小识别单位:351NFGRSYFDP359。通过3D模拟,发现此表位位于N蛋白的外侧,其与CDV阳性血清具备一定的ELISA反应能力。通过比对,其与CDV同属麻疹病毒、牛瘟病毒,小反刍兽疫病毒一致,并对小反刍兽疫病毒进行了WB验证,其结果为阳性。以杂交瘤细胞1N8为模板,分离出抗体轻链和重链可变区,通过基因工程的方式组装成单链抗体,通过原核表达,获得了重组1N8单链抗体蛋白,经过间接ELISA和竞争ELISA方法检测,其具备1N8单抗的部分活性。以腺病毒为表达载体,研究了351NFGRSYFDP359表位疫苗的免疫效力:构建含351NFGRSYFDP359表位和肠炎细小病毒VP2基因的表达盒,通过PCR和WB检测,重组腺病毒在核酸和蛋白水平上均能表达出外源片段。小鼠免疫试验显示:与商品化对照疫苗相比,重组腺病毒的CPV的ELISA效价与之相当,但CDV的ELISA效价比较低。最后,在本研究开展了CPV VP2基因遗传变异研究:历经4年,收集到我国主要城市的犬细小病毒阳性样品37份,分离病毒8株,获得犬细小病的阳性样品VP2基因序列22份,其中CPV-2a型20份,CPV-2b型2份,测序结果显示我国CPV存在CPV-2a(Ser297Ala)变异,而且CPV VP2基因序列相似度为99.3-99.9%,系统发育树证明本次分离的大多数CPV毒株为一个大的分支中,与泰国KU143-09株类似,且不呈现地域相关性。
【关键词】：犬瘟热病毒 核蛋白 单克隆抗体 犬细小病毒 遗传变异
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.655
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-16
• 英文缩略表16-17
• 第一章 引言17-30
• 1.1 犬瘟热病毒17-21
• 1.1.1 犬瘟热病毒病原学17-19
• 1.1.2 犬瘟热病毒基因组及N蛋白研究进展19-21
• 1.2 犬瘟热病毒单克隆抗体的研究21-23
• 1.2.1 犬瘟热病毒单克隆抗体的制备21
• 1.2.2 犬瘟热病毒B细胞表位21-22
• 1.2.3 犬瘟热病毒单链抗体22-23
• 1.3 犬瘟热病毒诊断技术研究23-24
• 1.3.1 犬瘟热病毒病原学诊断24
• 1.3.2 犬瘟热病毒血清学诊断24
• 1.4 犬瘟热病毒疫苗研究进展24-25
• 1.4.1 犬瘟热病毒毒株及疫苗24-25
• 1.4.2 犬瘟热病毒新型疫苗25
• 1.4.3 犬瘟热病毒免疫失败原因25
• 1.5 腺病毒作为载体在动物疫苗中的研究进展25-26
• 1.6 肉食动物细小病毒26-29
• 1.6.1 肉食动物细小病毒概述26-27
• 1.6.2 基因组特征27
• 1.6.3 犬细小病毒27-28
• 1.6.4 犬细小病毒变异和VP2蛋白氨基酸突变28
• 1.6.5 我国犬细小病毒流行状况28-29
• 1.7 研究的目的和意义29-30
• 第二章 CDV N蛋白单克隆抗体的制备30-41
• 摘要30
• 2.1 材料与方法30-36
• 2.1.1 主要实验试剂30-31
• 2.1.2 毒株及实验动物31
• 2.1.3 主要仪器和耗材31
• 2.1.4 N蛋白截短蛋白(aa277-471)基因PCR31
• 2.1.5 N蛋白截短蛋白(aa277-471)表达载体构建31-32
• 2.1.6 p EASY-N表达菌株诱导表达32-33
• 2.1.7 重组CDV-N蛋白表达预处理33
• 2.1.8 N蛋白表达Ni-NTA纯化33
• 2.1.9 N蛋白SDS-PAGE分析33
• 2.1.10 CDV-N蛋白免疫程序33
• 2.1.11 N蛋白间接ELISA检测方法的建立33-34
• 2.1.12细胞融合试验34
• 2.1.13阳性杂交瘤细胞的筛选34
• 2.1.14 MAbs腹水的制备34-35
• 2.1.15间接免疫荧光（IFA）鉴定35
• 2.1.16 MAb的Western blot鉴定35
• 2.1.17 MAb上清与腹水效价测定以及亚类鉴定35
• 2.1.18 MAb 的初步应用：抗体与 HRP 及 488 偶联35-36
• 2.2 结果36-40
• 2.2.1 N基因的PCR扩增36
• 2.2.2 重组供体质粒p EASY-N的鉴定36
• 2.2.3 p EASY-N重组质粒的表达与纯化36-37
• 2.2.4 间接ELISA检测法的建立37
• 2.2.5 阳性杂交瘤细胞株的获得37
• 2.2.6 MAb上清与腹水效价测定以及亚型鉴定37-38
• 2.2.7 MAb的IFA鉴定38-39
• 2.2.8 MAb的Western blot鉴定39
• 2.2.9 MAb的初步应用：抗体与HRP及488偶联39-40
• 2.3 讨论40-41
• 2.3.1 CDV单克隆抗体的制备40
• 2.3.2 选择CDV N蛋白的原因40
• 2.3.3 CDV单克隆抗体国内外应用进展40-41
• 第三章 筛选犬瘟热病毒N蛋白（AA 277-471）B细胞表位41-50
• 摘要41
• 3.1 材料与方法41-44
• 3.1.1 主要实验试剂41
• 3.1.2 单克隆抗体 1N8的纯化41-42
• 3.1.3 噬菌体筛选与扩增42
• 3.1.4 阳性噬菌体序列测定42
• 3.1.5 犬瘟热病毒N蛋白（aa277-471）合成肽的制备42-43
• 3.1.6 抗原表位的初步鉴定（肽扫描）43
• 3.1.7 抗原表位的精确鉴定43
• 3.1.8 抗原表位的特异性鉴定43
• 3.1.9 抗原表位合成多肽与CDV阳性/阴性血清ELISA反应43
• 3.1.10 抗原表位的 3D位置43-44
• 3.2 实验结果44-48
• 3.2.1 单抗腹水纯化44
• 3.2.2 肽库淘选44
• 3.2.3 随机噬菌体的测序结果44-45
• 3.2.4 肽扫描结果45
• 3.2.5 抗原表位的精确鉴定45-46
• 3.2.6 抗原表位的比对46-47
• 3.2.7 1N8与小反刍兽疫病毒的WB检验47
• 3.2.8 抗原表位351NFGRSYFDP359在N蛋白中的 3D位置47-48
• 3.2.9 抗原表位351NFGRSYFDP359与CDV阳性血清反应能力48
• 3.3 讨论48-50
• 3.3.1 CDV N蛋白B细胞抗原表位48
• 3.3.2 麻疹病毒属N蛋白抗原表位分析48-50
• 第四章 基于杂交瘤细胞 1N8的单链抗体制备与鉴定50-57
• 摘要50
• 4.1 材料与方法50-53
• 4.1.1 细胞与菌株50
• 4.1.2 主要实验试剂50
• 4.1.3 引物设计50-51
• 4.1.4 杂交瘤的RNA提取，c DNA合成和基因扩增51
• 4.1.5 单链抗体sc Fv/1N8 gene的合成51
• 4.1.6 原核表达重组质粒的构建51-52
• 4.1.7 单链抗体基因的序列比对分析52
• 4.1.8 单链抗体的表达52
• 4.1.9 重组蛋白的纯化52
• 4.1.10 重组蛋白的复性52
• 4.1.11 蛋白浓度的测定52-53
• 4.1.12 单链抗体活性检测53
• 4.2 结果53-56
• 4.2.1 sc Fv/1N8 gene基因的扩增结果53
• 4.2.2 sc Fv/1N8 gene基因的序列分析53-54
• 4.2.3 sc Fv/1N8重组蛋白的表达与纯化54
• 4.2.4 sc Fv/1N8重组蛋白的活性检测54-56
• 4.3 讨论56-57
• 4.3.1 CDV单链抗体的研究56
• 4.3.2 CDV单链抗体的构建方式56
• 4.3.3 CDV不同蛋白单链抗体的未来展望56-57
• 第五章 CDV 351NFGRSYFDP359表位疫苗研究57-65
• 摘要57
• 5.1 材料与方法57-59
• 5.1.1 腺病毒表达载体和试剂57
• 5.1.2 含目的基因(表位+VP2)的PCR扩增57-58
• 5.1.3 含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建58
• 5.1.4 重组腺病毒载体菌内重组鉴定58
• 5.1.5 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞58
• 5.1.6 重组腺病毒滴度（TCID50）的滴定58
• 5.1.7 重组腺病毒的形态学观察58
• 5.1.8 重组腺病毒的PCR鉴定58-59
• 5.1.9 重组腺病毒的WB鉴定59
• 5.1.10 重组病毒免疫小鼠实验59
• 5.2 结果59-63
• 5.2.1 PCR扩增结果59
• 5.2.2 含目的基因(表位+VP2)穿梭载体的构建结果59-60
• 5.2.3 重组腺病毒的包装60
• 5.2.4 重组病毒滴度（TCID50）的测定60-61
• 5.2.5 重组腺病毒的电镜观察61
• 5.2.6 重组腺病毒的VP2基因PCR结果61-62
• 5.2.7 重组腺病毒的Western blot检测62
• 5.2.8 重组腺病毒免疫小鼠后CPV抗体效价62
• 5.2.9 重组腺病毒免疫小鼠后CDV抗体效价62-63
• 5.3 讨论63-65
• 5.3.1 腺病毒载体的优势63
• 5.3.2 CPV VP2基因的VLP特征63-64
• 5.3.3 CDV表位疫苗64-65
• 第六章 犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析65-78
• 摘要65
• 6.1 材料与方法65-68
• 6.1.1 菌株、载体和试剂65
• 6.1.2 CPV基因组提取方法65-66
• 6.1.3 用于CPV毒株遗传进化分析的毒株信息66
• 6.1.4 CPV PCR扩增66-67
• 6.1.5 CPV特异性片段的PCR扩增与RFLP分析67
• 6.1.6 CPV VP2基因的克隆67
• 6.1.7 利用实时荧光定量PCR相对定量法检测CPV病毒含量67-68
• 6.1.8 犬细小病毒分离68
• 6.1.9 犬细小病毒系统发育树的构建68
• 6.2 试验结果68-76
• 6.2.1 样品中细小病毒的常规PCR鉴定68
• 6.2.2 犬细小病毒RFLP分析68-69
• 5.2.3 犬细小病毒病毒分离69
• 6.2.4 犬细小病毒VP2基因的克隆69-70
• 6.2.5 实时荧光定量PCR相对定量方法测定细小病毒载量70
• 6.2.6 犬细小病毒VP2基因的序列分析70-71
• 5.2.7 犬细小病毒VP2基因的同义突变与非同义突变71
• 6.2.8 CPV VP2基因系统发育树分析71-76
• 6.3 讨论76-78
• 6.3.1 我国CPV流行趋势分析76
• 6.3.2 VP2蛋白氨基酸变异分析76-77
• 6.3.3 我国CPV免疫保护分析77
• 6.3.4 CPV及其他犬科动物感染细小病毒联系77-78
• 第六章 全文结论78-79
• 附录79-84
• 参考文献84-97
• 致谢97-98
• 作者简历98

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张晓霞;马军武;周广青;代鹏;林密;冯霞;;抗口蹄疫病毒单链抗体cDNA T7噬菌体展示文库的构建[J];中国兽医科学;2013年03期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 殷秀辰;Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及其免疫效果评价[D];中国农业科学院;2013年

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本文编号：804273