达摩凤蝶细胞系的建立与蛋白表达特性研究

发布时间：2017-09-07 02:49

  本文关键词：达摩凤蝶细胞系的建立与蛋白表达特性研究

  更多相关文章： 达摩凤蝶 昆虫细胞系 杆状病毒 报告基因 表达水平

【摘要】：昆虫细胞培养技术是近年来迅速发展起来的细胞工程中的主要领域之一,广泛应用于医学、农业及生物学的各个方面。特别是昆虫细胞杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Victor System,BEVS)被广泛用于重组蛋白表达、工程疫苗和蛋白组学等领域,拥有巨大的开发潜力和应用前景。本文以鳞翅目(Lepidoptera)凤蝶科(Papilionidae)的达摩凤蝶Papilio demoleus Linnaeus新孵幼虫为试验材料,建立了4个达摩凤蝶细胞系,并对其原代及传代培养方法、基础生物学特性、冻存与复苏特性、病毒敏感性,以及对外源蛋白表达水平等方面进行了较详尽的研究。新昆虫细胞系的建立不但为离体条件下进行相关的昆虫生理生化、杆状病毒感染等研究提供实验材料,也为昆虫细胞系的建立研究、昆虫细胞工程研究奠定了一定的科学基础。主要的研究结果如下:1、达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的建立使用改良的Grace培养基并辅以20%胎牛血清对达摩凤蝶新孵幼虫组织进行体外培养。经过2年多的培养,最终有4瓶培养物传代超过50次且生物学特性稳定、生长一直良好,成为可稳定传代的达摩凤蝶新孵幼虫细胞系,分别命名为RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2、RIRI-Pa De-3,以及RIRI-Pa De-4。2、达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的基础生物学特性(1)细胞系来源的分子鉴定:通过比对4个达摩凤蝶细胞系和虫卵的细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)序列,结果显示来源于4株细胞系和虫卵的COI序列相似度为100%,证明4个新建细胞系来源于达摩凤蝶组织。(2)细胞形态学特征:4个达摩凤蝶细胞系均为贴壁生长型细胞,培养初期细胞种类多样,进入稳定传代期后,各细胞系的细胞形态组成出现一定差异。RIRI-Pa De-1细胞形态主要为圆形、梭形和多边形,其中圆形细胞占61.73±1.33%,直径从7.06μm至35.112μm不等,悬浮状态下细胞群体的平均直径为6.79±0.27μm。RIRI-Pa De-2细胞形态主要为圆形,直径从7.14μm至27.66μm不等,平均直径为13.920±0.025μm,悬浮状态下细胞群体的平均直径为6.87±0.27μm。RIRI-Pa De-3细胞形态主要为类似表皮细胞和纤维状细胞,悬浮状态下细胞群体的平均直径为6.66±0.56μm。RIRI-Pa De-4细胞形态主要为圆形、梭形和多边形,其中圆形细胞占58.35±4.22%,直径平均为13.813±0.421μm,悬浮状态下细胞群体的平均直径为6.71±0.47μm。(3)细胞增殖动力学特性:通过试验绘制了4个细胞系的生长曲线,计算各个细胞系的群体倍增时间分别为:RIRI-Pa De-1是69.77h,RIRI-Pa De-2是67.42h,RIRI-Pa De-3是81.48h,RIRI-Pa De-4是65.43h,其中,RIRI-Pa De-4细胞增殖一倍所需时间最短,RIRIPa De-3细胞系的倍增时间最长。(4)核型分析:经过试验比较发现,制片时使用的KCl低渗溶液最适浓度为0.60%。在1000倍光学显微镜下观察发现,4个达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的染色体呈点状聚集于核区,虽然数量众多,但统计结果呈正态分布。细胞系RIRI-Pa De-1(61代)的染色体数目分布区间为36~90,平均为63条;RIRI-Pa De-2(60代)的染色体数目分布区间为49~97,平均为73条;RIRI-Pa De-3(52代)的染色体数目分布区间为46~90,平均为68条;RIRI-Pa De-4(52代)的染色体数目分布区间为45~91,平均为68条。(5)冻存与复苏特性:通过对4个达摩凤蝶细胞系进行长期液氮深低温冷冻保存,分析冻存时间长短对细胞活力的影响,结果显示4个细胞系经过长期冻后活力均呈下降趋势。但复苏培养后能在短期(10d)内恢复活力,且生长特性不变,说明使用常规冻存操作方法能够实现达摩凤蝶细胞系在液氮中的长期保存与复苏。3、达摩凤蝶细胞系对6种昆虫杆状病毒的敏感性使用6种常见鳞翅目昆虫杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Ac MNPV、家蚕核型多角体病毒Bm NPV、春尺蠖核型多角体病毒Aci NPV、美国白蛾核型多角体病毒Hycu NPV、舞毒蛾核型多角体病毒Ld NPV,以及柞蚕核型多角体病毒Anpe NPV)对4个达摩凤蝶细胞系进行侵染测试,观察4个达摩凤蝶细胞系对病毒的反应,确定能够侵染达摩凤蝶细胞系的病毒。结果发现Ac MNPV能感染4个达摩凤蝶细胞系;Aci NPV和Hycu NPV均可感染RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2、RIRI-Pa De-4,不能感染RIRI-Pa De-3;其余3株病毒均不能感染达摩凤蝶细胞系。表明,4个达摩凤蝶细胞系都对Ac MNPV敏感,RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2,以及RIRI-Pa De-4细胞系对Aci NPV和Hycu NPV敏感;4个达摩凤蝶细胞系对Bm NPV、Ld NPV,以及Anpe NPV均不敏感。4、对3种报告基因表达水平的研究为了研究4个达摩凤蝶细胞系对重组外源基因的表达特性,本论文利用Bac-to-Bac#174;杆状病毒表达系统构建了3株携带不同报告基因的重组杆状病毒,分别为重组绿色荧光蛋白杆状病毒Ac MNPV-GFP、重组β-半乳糖苷酶杆状病毒Ac MNPV-Lac Z,以及重组分泌型碱性磷酸酶杆状病毒Ac MNPV-SEAP。通过感染达摩凤蝶细胞系和作为对照的Sf9和High Five细胞系,检测和比较重组蛋白在各细胞系中的表达水平。(1)达摩凤蝶细胞系对Ac MNPV-GFP敏感性:使用有限稀释法,测定达摩凤蝶细胞系、Sf9,以及High Five对Ac MNPV-GFP的半数组织培养感染剂量(Median Tissue Culture Infectious Dose,TCID50),获得结果为:RIRI-Pa De-2和RIRI-Pa De-4表达的绿色荧光蛋白量及其微弱,镜检无法观测到;High Five的TCID50最小(10-6.88),说明对Ac MNPV-GFP最敏感,其次是RIRI-Pa De-1(TCID50=10-6.55),之后为Sf9(TCID50=10-6.5),对Ac MNPVGFP敏感度最低的是RIRI-Pa De-3(TCID50=10-5.45)。(2)重组绿色荧光蛋白在达摩凤蝶细胞系中的表达水平:Sf9对重组绿色荧光蛋白的表达量最高。虽然细胞系RIRI-Pa De-1对Ac MNP-GFP敏感性比Sf9高,但重组绿色荧光蛋白的表达水平仅为Sf9的1/10,RIRI-Pa De-3的表达水平为Sf9的1/18,RIRI-Pa De-2和RIRI-Pa De-4的表达水平为Sf9的1/27,High Five表达重组绿色荧光蛋白的水平为Sf9的一半。(3)重组β-半乳糖苷酶在达摩凤蝶细胞系中的表达水平:重组β-半乳糖苷酶在4个达摩凤蝶细胞系中的表达水平均很低。接种Ac MNPV-Lac Z病毒48h后Sf9和High Five便开始显著表达重组β-半乳糖苷酶,此时4个达摩凤蝶细胞系中重组β-半乳糖苷酶活性非常低。96h后RIRI-Pa De-3细胞中检测到重组β-半乳糖苷酶活性升高,但仅为Sf9中β-半乳糖苷酶活性的1/11。216h后重组β-半乳糖苷酶在6个细胞中的表达量达到最大,High Five最高,其次为Sf9,RIRI-Pa De-3仅为High Five的1/8,RIRI-Pa De-4表达量排第4,约为High Five表达水平的1/18,RIRI-Pa De-2约为High Five的1/24,RIRI-Pa De-1表达水平最低。(4)重组分析型碱性磷酸酶在达摩凤蝶细胞系中的表达水平:重组SEAP在4个达摩凤蝶细胞系中的表达水平与Sf9和High Five的相当甚至更高。接种Ac MNPV-SEAP病毒48h后6个细胞系均显著表达重组SEAP。144h时RIRI-Pa De-1和RIRI-Pa De-2的表达量达增加最快。169h后各细胞系均达到表达最高峰,相互之间表达量相差不大。216h后各除RIRI-Pa De-3外,其他5个细胞系表达重组SEAP的水平均开始下降。到240h时,RIRI-Pa De-3仍保持较高的重组SEAP表达水平。结果表明,4个达摩凤蝶细胞系对重组SEAP的表达水平与Sf9和High Five相当,其中RIRI-Pa De-3细胞系对重组SEAP的表达水平显著高于Sf9和High Five,有开发和利用其作为杆状病毒表达系统宿主细胞系的潜力。综上所述,本文以达摩凤蝶新孵幼虫为试验材料建立了4个达摩凤蝶细胞系,其基础生物学特性、病毒敏感性,以及对外源蛋白表达水平等方面均有差异:4个达摩凤蝶细胞系均对Ac MNPV敏感,3个细胞系(RIRI-Pa De-1、RIRI-Pa De-2,以及RIRI-Pa De-4)对Aci NPV和Hycu NPV敏感;4个达摩凤蝶细胞系对重组绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶的表达水平均较低,但对重组分泌型碱性磷酸酶的表达水平高于Sf9和High Five,具有进一步研究的价值。
【关键词】：达摩凤蝶 昆虫细胞系 杆状病毒 报告基因 表达水平
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;Q813
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-20
• 第一章 绪论20-32
• 1.1 引言20-21
• 1.1.1 研究背景20
• 1.1.2 研究目的和意义20-21
• 1.1.3 项目来源与经费支持21
• 1.2 国内外研究现状与评述21-29
• 1.2.1 昆虫细胞培养的一般概况21-22
• 1.2.2 昆虫细胞的研究、应用现状以及发展趋势22-29
• 1.3 研究目标和主要研究内容29-31
• 1.3.1 研究目标29-30
• 1.3.2 研究的主要内容30-31
• 1.4 研究技术路线31-32
• 第二章 达摩凤蝶细胞系的建立及生物学特性研究32-57
• 2.1 试验材料与方法32-40
• 2.1.1 试验材料32-34
• 2.1.2 试验方法34-40
• 2.2 结果与分析40-55
• 2.2.1 达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的建立40-44
• 2.2.2 达摩凤蝶新孵幼虫细胞系的生物学特性44-53
• 2.2.3 达摩凤蝶细胞系的冻存与复苏53-55
• 2.3 小结55-57
• 第三章 达摩凤蝶细胞系的病毒敏感性研究57-67
• 3.1 试验材料与方法57-59
• 3.1.1 试验材料57-59
• 3.1.2 试验方法59
• 3.2 结果与分析59-66
• 3.2.1 RIRI-PaDe-1 细胞系对6种昆虫杆状病毒的敏感性59-60
• 3.2.2 RIRI-PaDe-2 细胞系对6种昆虫杆状病毒的敏感性60
• 3.2.3 RIRI-PaDe-3 细胞系对6种昆虫杆状病毒的敏感性60-65
• 3.2.4 RIRI-PaDe-4 细胞系对6种昆虫杆状病毒的敏感性65-66
• 3.3 小结66-67
• 第四章 重组绿色荧光蛋白在达摩凤蝶细胞系中的表达67-81
• 4.1 试验材料与方法67-76
• 4.1.1 试验材料67-70
• 4.1.2 试验方法70-76
• 4.2 结果与分析76-80
• 4.2.1 重组绿色荧光蛋白杆状病毒(AcMNPV-GFP)的构建结果76-78
• 4.2.2 达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-GFP的敏感性78-79
• 4.2.3 重组GFP在达摩凤蝶细胞系中表达量的测定79-80
• 4.3 小结80-81
• 4.3.1 达摩凤蝶细胞系对AcMNPV-GFP的敏感性80
• 4.3.2 重组GFP在达摩凤蝶细胞系中的表达水平80-81
• 第五章 重组 β-半乳糖苷酶在达摩凤蝶细胞系中的表达81-93
• 5.1 试验材料与方法81-87
• 5.1.1 试验材料81-83
• 5.1.2 试验方法83-87
• 5.2 结果与分析87-92
• 5.2.1 重组 β-半乳糖苷酶杆状病毒(AcMNPV-LacZ)的构建结果87-88
• 5.2.2 重组 β-半乳糖苷酶在达摩凤蝶细胞系中表达量的测定88-92
• 5.3 小结92-93
• 第六章 重组分泌型碱性磷酸酶在达摩凤蝶细胞系的表达93-104
• 6.1 试验材料与方法93-99
• 6.1.1 试验材料93-95
• 6.1.2 试验方法95-99
• 6.2 结果与分析99-103
• 6.2.1 重组分泌型碱性磷酸酶杆状病毒(AcMNPV-SEAP)的构建结果99-100
• 6.2.2 重组分泌型碱性磷酸酶在达摩凤蝶细胞系中的表达的水平测定100-103
• 6.3 小结103-104
• 第七章 结论与讨论104-116
• 7.1 结论104-107
• 7.2 创新点107
• 7.3 讨论107-114
• 7.4 展望114-116
• 参考文献116-129
• 在读期间的学术研究129-130
• 致谢130

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张垲;余冰菲;陈瑞川;刘润忠;;荧光定量检测细胞绿色荧光蛋白技术的建立与应用[J];厦门大学学报(自然科学版);2008年S2期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 郑桂玲;鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立和高蛋白表达细胞克隆株的研究[D];山东农业大学;2010年

，

本文编号：806991