基于等温酶循环放大技术的DNA生物传感分析及应用研究

发布时间：2017-09-07 03:41

  本文关键词：基于等温酶循环放大技术的DNA生物传感分析及应用研究

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【摘要】：本文采用石英晶体微天平及荧光光谱分析检测方法,基于核酸适体与目标分子的高亲和力以及特异性识别作用,结合纳米金生物条码技术及核酸聚合酶、内切酶等工具酶的自身特性,构建了基于酶循环信号放大方法、DNA自组装信号放大方法、滚环复制与自组装循环放大相结合、等温链置换放大方法以及滚环复制放大方法,实现了生物小分子、基因及DNA甲基化酶等肿瘤标志物的高灵敏及高选择性检测。主要内容如下:1、构建了新型的石英晶体微天平传感器,结合DNA酶循环放大方法实现了对ATP的高灵敏检测。将适体的特异性识别作用与DNA酶循环放大相结合,以纳米金生物条码作为信号探针,通过链替代聚合反应,将信号探针与修饰在芯片表面的捕获探针相结合,使检测信号显著增强,以生物小分子ATP为靶分子,检测限达1.3 n M。利用核酸适体的特异性识别特点,提高了检测的选择性,并将该方法用于肿瘤细胞(Ramos)中ATP含量的测定,进一步验证了检测系统的实用性。该方法灵敏度高,选择性好,适用于复杂生物样品中ATP的选择性分析,为生物学研究、基于检测以及肿瘤的早期诊断提供了有效的分析手段。2、提出了自组装杂交链式反应放大的石英晶体微天平检测DNA的新方法。将自组装杂交链式反应与生物催化沉淀技术相结合,增大了芯片表面的质量,提高了检测灵敏度。通过芯片结合的靶DNA引发杂交链式反应,进一步进行生物催化沉淀,从而将少量的靶DNA转化成大量的沉淀物,放大检测信号,采用石英晶体微天平技术实现了靶DNA的高灵敏检测,检测限达5×10-11M。检测系统采用捕获探针修饰芯片,提高了系统的选择性,减小了非特异性吸附,有望用于单核苷酸多态性方面的研究。3、基于等温循环链置换聚合扩增技术,设计了ATP高灵敏检测的荧光传感系统。通过靶分子与适体的特异性识别作用引发链置换聚合反应,在DNA酶的作用下,一个链置换聚合反应的产物作为另一个反应的催化链,形成了DNA循环放大网络,提高了反应的放大效率,以ATP为目标分析物,荧光探针为检测信号,实现了ATP的快速、灵敏检测,检测限达2.6×10-10 M。成功应用于人血清实际样品中ATP的分析。该方法适用范围广、选择性强、操作便捷,在生物检测方面具有潜在的应用价值。4、构建了一种新型DNA级联循环放大分子机器,并将其成功应用于DNA的高灵敏检测。通过靶DNA的杂交互补反应引发模板增强杂交过程(TEHP),在DNA工具酶的作用下发生滚环复制放大反应(RCA),生成大量的具有重复序列的产物,在剪切酶作用下RCA产物引发发卡催化自组装循环反应(CHA),同时将模板链与靶释放出来形成源头循环。通过DNA级联循环放大,释放大量的荧光探针,极大地增强了荧光检测信号,从而实现了对DNA的高灵敏检测。DNA的检测限为1.2×10-18 M,系统中引入模板增强杂交过程,提高了靶DNA的选择性,为基因检测提供了有效的分析手段。5、提出了一种基于滚环复制放大技术荧光检测DNA甲基化酶的新方法。通过DNA甲基化反应生成DNA短链,该链作为RCA的前体与环状模板结合,在聚合酶作用下发生滚环复制放大反应,将荧光信号探针与带有大量重复序列的滚环复制的长链相结合,使检测信号显著增强,对DNA甲基化酶的检测限可达0.6 U/m L。运用该方法对抗癌药物的抑制效果进行研究,有望用于抗癌药物的筛选,通过检测DNA甲基化水平的变化在癌症早期风险评估及分子诊断治疗方面具有潜在应用价值。
【关键词】：循环放大 DNA 传感器 石英晶体微天平 荧光光谱 核酸适体
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q789
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-12
• 第一章 前言12-64
• 1.1 DNA生物传感器13-27
• 1.1.1 核酸14-18
• 1.1.2 DNA传感器的检测方法18-27
• 1.2 石英晶体微天平27-45
• 1.2.1 石英晶体微天平原理27-31
• 1.2.2 石英晶体微天平的构成及特点31-33
• 1.2.3 QCM生物传感器在生化分析中的应用33-45
• 1.3 荧光光谱检测技术45-56
• 1.3.1 荧光产生机理45-46
• 1.3.2 DNA荧光探针及其在生化分析中的应用研究46-56
• 1.4 等温循环放大技术及DNA传感分析的研究进展56-63
• 1.4.1 滚环复制放大56-58
• 1.4.2 链替代聚合放大58-59
• 1.4.3 核酸内切酶循环放大59-61
• 1.4.4 核酸外切酶循环放大61-63
• 1.5 本课题的意义和研究内容63-64
• 第二章 基于酶循环信号放大技术QCM检测ATP研究64-88
• 2.1 实验部分65-70
• 2.1.1 试剂65-67
• 2.1.2 仪器67
• 2.1.3 纳米金的制备67
• 2.1.4 纳米金生物条码的制备67-68
• 2.1.5 DNA标记磁性微球68
• 2.1.6 纳米金磁性微球复合物的制备68
• 2.1.7 芯片的清洗及修饰68
• 2.1.8 细胞内ATP的提取68-69
• 2.1.9 等温链替代循环放大反应69
• 2.1.10石英晶体微天平检测69
• 2.1.11高效液相色谱法（HPLC）检测ATP69-70
• 2.1.12聚丙烯酰胺凝胶电泳70
• 2.2 结果与讨论70-86
• 2.2.1 基于等温酶循环放大技术的石英晶体微天平检测原理70-71
• 2.2.2 金纳米粒子的表征71-72
• 2.2.3 纳米金生物条码的紫外光谱表征72-73
• 2.2.4 可行性研究73-76
• 2.2.5 非特异性吸附研究76-77
• 2.2.6 实验条件的优化77-82
• 2.2.7 酶循环信号放大QCM检测ATP的灵敏度82-85
• 2.2.8 酶循环信号放大QCM检测ATP的选择性85-86
• 2.2.9 癌细胞内ATP的检测86
• 2.3 小结86-88
• 第三章 基于自组装信号放大技术QCM检测DNA的研究88-97
• 3.1 实验部分89-90
• 3.1.1 试剂89
• 3.1.2 仪器89-90
• 3.1.3 芯片修饰90
• 3.1.4 石英晶体微天平检测90
• 3.2 结果与讨论90-96
• 3.2.1 基于自组装信号放大技术的石英晶体微天平检测DNA原理90-91
• 3.2.2 可行性研究91-92
• 3.2.3 实验条件的优化92-93
• 3.2.4 自组装信号放大QCM检测DNA的灵敏度93-95
• 3.2.5 自组装放大QCM检测DNA的选择性95-96
• 3.3 小结96-97
• 第四章 基于等温循环链置换放大荧光检测ATP的研究97-112
• 4.1 实验部分98-100
• 4.1.1 试剂98-99
• 4.1.2 仪器99
• 4.1.3 DNA标记磁性微球99-100
• 4.1.4 等温循环链置换聚合放大反应100
• 4.1.5 荧光光谱检测100
• 4.2 结果与讨论100-111
• 4.2.1 基于等温循环链置换聚合放大反应检测ATP原理100-101
• 4.2.2 DNA标记磁珠的紫外光谱表征101-102
• 4.2.3 可行性研究102-103
• 4.2.4 实验条件的优化103-106
• 4.2.5 荧光检测ATP的灵敏度检测106-110
• 4.2.6 ATP的选择性检测110-111
• 4.2.7 实际样品中ATP的检测111
• 4.3 小结111-112
• 第五章 基于滚环复制与自组装循环放大荧光检测DNA的研究112-130
• 5.1 实验部分113-115
• 5.1.1 试剂113-114
• 5.1.2 仪器114
• 5.1.3 DNA级联循环放大反应114-115
• 5.1.4 荧光光谱检测115
• 5.2 结果与讨论115-128
• 5.2.1 基于DNA级联循环放大反应检测原理115-116
• 5.2.2 可行性研究116-118
• 5.2.3 信号放大性能的研究118-119
• 5.2.4 实验条件的优化119-122
• 5.2.5 基于级联信号放大荧光检测DNA的灵敏度122-127
• 5.2.6 DNA检测的选择性127-128
• 5.3 小结128-130
• 第六章 基于滚环复制信号放大荧光检测DNA甲基化的研究130-142
• 6.1 实验部分131-133
• 6.1.1 试剂131-132
• 6.1.2 仪器132
• 6.1.3 环状DNA的制备132
• 6.1.4 滚环复制放大反应检测甲基化酶132-133
• 6.1.5 荧光光谱检测133
• 6.2 结果与讨论133-140
• 6.2.1 基于滚环复制信号放大反应检测原理133-134
• 6.2.2 可行性研究134-135
• 6.2.3 实验条件的优化135-137
• 6.2.4 基于滚环复制信号放大荧光检测DNA甲基化酶的灵敏度137-138
• 6.2.5 药物对DNA甲基化酶的活性研究138-140
• 6.2.6 DNA甲基化酶的选择性研究140
• 6.3 小结140-142
• 参考文献142-171
• 结论171-173
• 致谢173-174
• 攻读学位期间发表的学术论文174-176

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本文编号：807224