两种二十面体病毒MCMV、CarMV衣壳结构及MCMV复制位点的电镜三维重构研究

发布时间：2017-09-13 17:12

  本文关键词：两种二十面体病毒MCMV、CarMV衣壳结构及MCMV复制位点的电镜三维重构研究

  更多相关文章： 玉米褪绿斑驳病毒 麝香石竹斑驳病毒 三维结构 复制 细胞病理学 单颗粒技术 电子断层成像技术 电子显微学

【摘要】：玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus, MCMV)和麝香石竹斑驳病毒(Carnation mottle virus, CarMV)分别是番茄丛矮病毒科Tombusviridae玉米褪绿斑驳病毒属Machlomovirus和麝香石竹斑驳病毒属Carmovirus代表成员。本研究利用冷冻电镜单颗粒技术对MCMV、CarMV病毒粒子进行三维重构,同时结合传统的电子显微技术,对MCMV细胞内复制场所及细胞病理进行探索。应用冷冻电镜单颗粒技术对MCMV病毒粒子的三维结构进行解析,获得该病毒粒子3.6埃分辨率的结构,揭示了衣壳蛋白亚基C-端序列的空间位置,显示了MCMV不对称单元的高度紧凑性。结合病毒粒子表面2-次对称轴附近的缝隙,说明不对称单元在MCMV结构稳定中起着非常重要的作用。通过与其他病毒表面结构特征比较,分析了暴露于病毒粒子表面的残基位点,揭示了该病毒与介体传播相关的功能位点,为进一步研究MCMV的传播机制提供了必要的结构证据。同时对获得的番茄丛矮病毒科与南方大豆花叶病毒属Sobemovirus 12种病毒的衣壳蛋白,进行氨基酸序列,亚基结构及二十面体结构的比较,发现MCMV与番茄丛矮病毒科藜属成员藜花叶病毒(Panicum Mosaic Virus, PMV)具有很近的亲缘关系。同时,利用冷冻电镜单颗粒技术对CarMV在四种条件下(Ca-pH7、EDTA-pH7、Ca-pH5和EDTA-pH5)的三维结构进行重构,四个重构之间的结构差异表明钙离子对CarMV粒子结构维持不起主要作用。结合病毒衣壳内表面电荷分布,推测不对称单元中心为CarMV基因组脱衣壳提供通道,了解CarMV基因组脱衣壳机制,对CarMV引起的病毒病防治具有重要意义。对感染MCMV的玉米叶片进行细胞病理分析,发现病毒粒子在细胞质中大量积累,过氧化物体和线粒体病变显著：过氧化物酶体增生并聚集,膜内侧形成周边小泡,后期发展成多泡体。通过对复制中间产物及复制酶进行免疫胶体金标记,确定MCMV基因组复制发生在过氧化物酶体膜周边小泡内。通过电子断层成像技术对膜周边小泡结构进行三维重构,发现膜周边小泡结构源于过氧化物酶体膜内陷。同时发现多泡体内含有尺寸较大且包含无定形物质大泡结构,利用电子断层成像技术对相邻多泡体之间连接进行三维重构,发现大泡结构源于多泡体膜的局部内陷。利用MCMV多克隆抗体对病毒衣壳蛋白进行免疫胶体金标记,结果发现病毒的衣壳蛋白除了定位在细胞质,在大泡中也大量存在,结合病毒侵染后期多泡体中结晶状排列的病毒粒子,推测MCMV组装发生在多泡体大泡中。对结晶状排列病毒粒子的取向进行分析,发现病毒粒子通过围绕5次对称轴loop进行相互作用,推测这种相互作用在病毒粒子组装及释放中起着非常重要的作用。线粒体病变主要是囊泡化,在囊泡中积累大量丝状物质,且病变程度随侵染时间的加长而加剧。高压冷冻结果进一步表明,丝状物质在膜间隙中积累导致线粒体缢裂成多个小线粒体结构,推测MCMV侵染导致了线粒体结构的异常增生。对MCMV细胞病理和复制机理的电子显微学研究,对揭示MCMV生命周期,进一步探索该病毒的侵染机制提供了理论依据,对MCMV引起的病毒病防治具有指导意义。
【关键词】：玉米褪绿斑驳病毒 麝香石竹斑驳病毒 三维结构 复制 细胞病理学 单颗粒技术 电子断层成像技术 电子显微学
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.41
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-18
• 1 文献综述18-45
• 1.1 冷冻电镜三维重构技术18-26
• 1.1.1 三维重构的基本原理19-21
• 1.1.2 冷冻制样技术21-22
• 1.1.3 冷冻电镜成像技术22-23
• 1.1.3.1 反差形成机制22
• 1.1.3.2 低剂量成像技术22-23
• 1.1.4 图像的解调制23-24
• 1.1.5 冷冻电镜技术中的新装备24-26
• 1.2 电镜三维重构基本方法26-36
• 1.2.1 单颗粒技术26-31
• 1.2.1.1 基本流程26-27
• 1.2.1.2 二维投影的对中27
• 1.2.1.3 二维投影的平均化处理27-28
• 1.2.1.4 三维结构的计算28-29
• 1.2.1.5 分辨率评估29
• 1.2.1.6 单颗粒技术的应用29-30
• 1.2.1.7 单颗粒技术存在的主要问题及解决30-31
• 1.2.2 电子断层成像技术31-36
• 1.2.2.1 电子断层成像技术的基本流程31-32
• 1.2.2.2 样品制备32
• 1.2.2.3 图像采集32-34
• 1.2.2.4 二维投影的三维重构34
• 1.2.2.5 电子断居成像技术的应用34-35
• 1.2.2.6 电子断层成像技术目前存在的问题35-36
• 1.3 二十面体病毒的冷冻电镜研究36-39
• 1.3.1 二十面体病毒的结构特点36-37
• 1.3.2 二十面体的取向和中心估算37-39
• 1.4 正义RNA病毒复制机制研究39-42
• 1.4.1 单链正义RNA病毒复制场所的形态39-41
• 1.4.2 RNA依赖性的RNA聚合酶结构及机理41-42
• 1.5 本论文研究的主要内容和意义42-45
• 1.5.1 本论文研究的主要内容42-43
• 1.5.2 本论文选题的意义43-45
• 2 玉米褪绿斑驳病毒粒子的冷冻电镜三维重构45-85
• 2.1 前言45-46
• 2.2 材料和方法46-55
• 2.2.1 毒源46
• 2.2.2 试剂和设备46
• 2.2.2.1 试剂和耗材46
• 2.2.2.2 仪器和软件46
• 2.2.3 病毒的摩擦接种46-47
• 2.2.4 病毒粒子的提纯47
• 2.2.4.1 病毒粒子初提纯47
• 2.2.4.2 病毒粒子精细提纯47
• 2.2.5 提纯病毒样品的电镜负染色观察47-48
• 2.2.6 冷冻样品的制备48-50
• 2.2.6.1 冷冻样品的制备48-49
• 2.2.6.2 冷冻样品的转移49-50
• 2.2.7 冷冻电镜图像采集50-52
• 2.2.7.1 冷冻电镜状态的调节50-51
• 2.2.7.2 冷冻电镜图像的采集51-52
• 2.2.8 冷冻电镜图像处理52
• 2.2.9 冷冻电镜三维重构52-53
• 2.2.10 MCMV氨基酸序列的同源建模53
• 2.2.11 模型的优化及验证53-54
• 2.2.12 MCMV衣壳蛋白保守结构域的预测54
• 2.2.13 结构与序列的下载54-55
• 2.2.14 氨基酸序列的多序列对比及系统进化树的构建55
• 2.3 结果55-80
• 2.3.1 玉米褪绿斑驳病毒的电镜负染色结果55-56
• 2.3.2 MCMV粒子冷冻电镜照片质量评估56-57
• 2.3.3 病毒粒子的框选57
• 2.3.4 病毒粒子的CTF校正57-59
• 2.3.5 MCMV初始模板的获得59-60
• 2.3.6 基于获得的初始模板对MCMV重构进行精修60-63
• 2.3.7 MCMV的三维重构结果63-74
• 2.3.7.1 MCMV粒子的三维结构63-64
• 2.3.7.2 MCMV三维重构分辨率的评估64-66
• 2.3.7.3 不对称单元的亚基组成66-67
• 2.3.7.4 MCMV模型的建立67-69
• 2.3.7.5 MCMV重构电子密度图的质量69
• 2.3.7.6 潜在的钙离子结合位点69-70
• 2.3.7.7 不对称单元之间的相互作用分析70-71
• 2.3.7.8 内部核酸结合位点分析71-73
• 2.3.7.9 表面功能位点分析73-74
• 2.3.8 基于氨基酸序列进行多序列比对结果分析74-77
• 2.3.9 基于衣壳蛋白氨基酸序列的进化分析77-78
• 2.3.10 基于病毒形态结构的分类78-80
• 2.4 讨论80-85
• 2.4.1 MCMV粒子的稳定因素80-82
• 2.4.2 基因组RNA与病毒衣壳的相互作用82
• 2.4.3 MCMV表面的功能位点分析82-83
• 2.4.4 MCMV的进化分析83-85
• 3 麝香石竹斑驳病毒粒子的冷冻电镜三维重构85-106
• 3.1 前言85-86
• 3.2 材料与方法86-90
• 3.2.1 毒源的获得及鉴定86
• 3.2.2 试剂和设备86-87
• 3.2.2.1 试剂和耗材86
• 3.2.2.2 仪器和软件86-87
• 3.2.3 病毒粒子的提纯及负染色观察87
• 3.2.4 冷冻样品的制备87-88
• 3.2.4.1 冷冻样品的制备87-88
• 3.2.4.2 冷冻样品的转移88
• 3.2.5 冷冻电镜图像采集88-90
• 3.2.5.1 冷冻电镜状态的调节88-89
• 3.2.5.2 冷冻电镜图像的采集89-90
• 3.2.5.3 冷冻电镜低剂量模式下图像采集90
• 3.2.6 冷冻电镜图像处理90
• 3.2.7 冷冻电镜三维重构90
• 3.3 结果90-103
• 3.3.1 CarMV粒子的提纯及负染色观察90-91
• 3.3.2 CarMV粒子冷冻电镜观察结果91-92
• 3.3.3 CarMV粒子的三维结构92-94
• 3.3.4 不对称单元内亚基相关性比较94-95
• 3.3.5 CarMV三维结构的大小比较95-96
• 3.3.6 分辨率的评估96-97
• 3.3.7 不对称单元内亚基间相互作用比较97-100
• 3.3.8 CarMV粒子内部核酸分布分析100-103
• 3.4 讨论103-106
• 3.4.1 CarMV冷冻电镜三维重构中的钙离子分布103
• 3.4.2 CarMV中钙离子的作用103-104
• 3.4.3 CarMV病毒基因组出壳机制探索104-106
• 4 玉米褪绿斑驳病毒细胞病理及复制机制电子显微学106-143
• 4.1 前言106-107
• 4.2 材料与方法107-120
• 4.2.1 毒源与植物材料107
• 4.2.2 试剂和仪器107-108
• 4.2.2.1 试剂和耗材107
• 4.2.2.2 仪器和软件107-108
• 4.2.3 摩擦接种108
• 4.2.4 茎杆注射法108
• 4.2.5 电镜样品的制备108-110
• 4.2.5.1 常规电镜样品制备方法108-109
• 4.2.5.2 低温包埋样品制备方法109
• 4.2.5.3 高压冷冻样品制备方法109-110
• 4.2.6 免疫胶体金标记110
• 4.2.7 MCMV复制酶P111的生物信息学分析110-111
• 4.2.7.1 P111的复制酶跨膜区预测111
• 4.2.7.2 P111保守结构域预测111
• 4.2.7.3 P111蛋白的同源建模111
• 4.2.8 MCMV复制酶特异性抗体制备111-118
• 4.2.8.1 MCMV复制酶P111片段的克隆及表达111-113
• 4.2.8.2 含有目的基因的克隆载体构建113-118
• 4.2.9 电子断层成像技术118-120
• 4.2.9.1 样品制备118-119
• 4.2.9.2 TF20透射电镜状态调节119
• 4.2.9.3 图像采集119
• 4.2.9.4 数据处理119-120
• 4.3 结果120-138
• 4.3.1 P111蛋白C端部分序列的原核表达及蛋白纯化120-124
• 4.3.2 感染MCMV的田间玉米细胞病理变化124-125
• 4.3.3 MCMV侵染玉米中过氧化物酶体的病变125-128
• 4.3.4 MCMV复制酶P111的亚细胞定位分析128-129
• 4.3.5 MCMV复制中间产物dsRNA亚细胞定位分析129-130
• 4.3.6 过氧化物酶体复制小泡的电子断层三维重构130-132
• 4.3.7 相邻过氧化物酶体之间的连接关系132
• 4.3.8 过氧化物酶体中无定形物质的免疫胶体金标记132-133
• 4.3.9 病毒粒子在细胞质结晶状聚集体中的取向分布133-135
• 4.3.10 MCMV侵染对线粒体结构及细胞能量代谢的影响135-137
• 4.3.11 线粒体病变过程的模型137-138
• 4.4 讨论138-143
• 4.4.1 MCMV复制酶的亚细胞定位分析138-139
• 4.4.2 MCMV的RNA复制场所139-140
• 4.4.3 病毒因子诱导膜增生的机理140
• 4.4.4 MCMV组装位点分析140-141
• 4.4.5 MCMV侵染对线粒体结构的影响141-143
• 5 全文小结及研究展望143-145
• 5.1 全文小结143-144
• 5.2 研究展望144-145
• 附文1 马铃薯Y病毒粒子胞间运动的电子显微学证据145-157
• 1.1 前言145-146
• 1.2 材料与方法146-147
• 1.2.1 试剂和仪器146
• 1.2.1.1 试剂和耗材146
• 1.2.1.2 仪器和设备146
• 1.2.2 毒源及病毒接种146
• 1.2.3 透射电镜样品制备146-147
• 1.2.4 免疫胶体金标记147
• 1.2.5 电子断层成像技术数据收集及图像处理147
• 1.2.6 同源建模147
• 1.3 结果147-154
• 1.3.1 Potyvirus柱状内含体的形态结构147-148
• 1.3.2 病毒衣壳蛋白的免疫胶体金标记148-150
• 1.3.3 柱状内含体促进病毒粒子穿过胞间连丝150-152
• 1.3.4 CI与病毒衣壳蛋白互作机制152-154
• 1.4 讨论154-157
• 1.4.1 病毒粒子与柱状内含体的结合方式154-155
• 1.4.2 病毒粒子的胞间运输形式155-156
• 1.4.3 病毒粒子离开Cl潜在动力来源156-157
• 参考文献157-177
• 附录A 缩写词及中英文对照177-179
• 附录B 常用缓冲液及培养基配方179-183
• 作者简历及其在校期间取得的科研成果183

，

本文编号：844962