棕色固氮菌褐藻胶诱导大豆生成大豆抗毒素的研究

发布时间：2017-09-15 15:47

  本文关键词：棕色固氮菌褐藻胶诱导大豆生成大豆抗毒素的研究

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【摘要】：源于细菌如固氮菌(Azotobacter)的褐藻胶往往有着优于海藻褐藻胶的品质,可用作植物外源诱导剂。与同样能够分泌褐藻胶的假单胞菌(Pseudomonas)相比,由于假单胞菌具有致病性且其产生的褐藻胶凝胶能力较弱,因此固氮菌成为生产褐藻胶的优选菌种。采用发酵和提取等方法可从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)培养液中制备出高品质的褐藻胶。棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的生长与代谢取决与培养基中的不同营养成分。关于褐藻胶的研究大多集中其化学特性、理化性质和食品应用方面,例如化学结构、分子大小、凝胶特性等等。目前尚未有关注细菌褐藻胶诱导植物化学活性物质生成尤其是对大豆中生物活性成分的诱导作用的研究。通常情况下,植物对于抵抗外源侵染的最有效的手段是在体内累积生成具有抗菌活性、低分子量的次级代谢物质即所谓的植物抗毒素。植物抗毒素在植物防御机制上发挥的作用已经由一些实验方法揭示出来。大豆中的异黄酮类植物抗毒素如大豆抗毒素glyceollin有着雌激素的功效,且被认为具有潜在地降低人体某些疾病和预防癌症的效果。本课题主要对棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)来源的褐藻胶对于大豆中大豆抗毒素glyceollin的诱导效果进行了研究,具体阐述了从棕色固氮菌培养液中提取制备细菌褐藻胶的方法以及细菌褐藻胶诱导大豆生成大豆抗毒素glyceollin的实验过程和对大豆中大豆抗毒素glyceollin累积的诱导能力。实验中采用高效液相色谱(HPLC)法定性和定量检测从棕色固氮菌培养液中提取的细菌褐藻胶样品,采用超高效液相色谱串联电喷质谱(UPLC-ESI-MS)法检测细菌褐藻胶酸解产物及诱导产生的大豆抗毒素glyceollin的分子量,采用薄层层析(TLC)法检测细菌褐藻胶酸解酸解产物中古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)的含量。通过研究诱导剂细菌褐藻胶的浓度、大豆浸泡时间以及诱导培养温度、培养湿度和培养时间,对诱导条件进行了优化,并比较了分别以细菌褐藻胶和米曲霉作为诱导剂在上述最佳诱导培养条件下诱导大豆生成大豆抗毒素glyceollin的效果。棕色固氮菌的培养结果表明,棕色固氮菌培养液中细菌褐藻胶的量为6.25 mg/m L菌液,生成的细菌褐藻胶的分子量为2.5 x 105 Da。从TLC检测结果可以看出细菌褐藻胶主要由G和M两种单糖组成。棕色固氮菌分泌的细菌褐藻胶可诱导大豆中大豆抗毒素的合成,最佳诱导的条件为:细菌褐藻胶浓度0.24mg/m L,加入量30μL,大豆浸泡时间5h,培养温度30℃,培养湿度40%,培养时间4d。在最佳诱导条件下,源于棕色固氮菌的细菌褐藻胶诱导大豆生成大豆抗毒素的累积量为1.775 mg/g大豆干重,而经海藻褐藻胶诱导的大豆中大豆抗毒素的累积量为0.012 mg/g大豆干重,经切口处理但未加诱导剂的大豆中大豆抗毒素的累积量为0.154 mg/g大豆干重。本实验中有关细菌褐藻胶的提取和制备以及用于诱导大豆抗毒素累积的研究方法,对于食品工业和医药工业开发高抗氧化活性产品具有实际应用价值。尽管本研究确定了在最佳诱导条件下细菌褐藻胶对大豆中大豆抗毒素的诱导效果,但是大豆抗毒素在药物制剂方面的潜在应用价值及作为一种生物活性物质在功能食品生产上的利用价值还需进行深入研究与开发。本研究结果对于源于棕色固氮的细菌褐藻胶在医药制品及功能食品生产上的应用具有重要的意义。
【关键词】：棕色固氮菌 细菌褐藻胶 大豆 大豆抗毒素 诱导
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93;TQ929
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-17
• CHAPTER 1 INTRODUCTION17-19
• 1.1. General introduction and research objectives17-18
• 1.2. Research objectives18
• 1.3. Research hypothesis18
• 1.4. Scope and limitation of the study18
• 1.5. Expected results18-19
• CHAPTER 2 LITERATURE REVIEW19-35
• 2.1. Alginate background19-26
• 2.1.1. Chemical structure19-22
• 2.1.2. Physical properties of alginate22
• 2.1.3. Solubility22-23
• 2.1.4. Selective ion binding23-24
• 2.1.5. Ionic cross-linking and Gel formation24-25
• 2.1.6. Application of alginate25
• 2.1.7. The use of alginate in the paper industry25
• 2.1.8. In the food industry25-26
• 2.2. Welding of rods application26-28
• 2.2.1. Alginate used as binders to fish feed26-27
• 2.2.2. Mould release agents27
• 2.2.3. Applications in biotechnology27
• 2.2.4. Use of alginate in the textile industry27-28
• 2.2.5. Alginate application in medical and pharmaceutical industry28
• 2.2.6. The use of alginate in water treatment28
• 2.3 Azotobacter vinelandii28-31
• 2.3.1 Alginate production by Azotobacter vinelandii28-29
• 2.3.2 Life cycle of Azotobacter29-30
• 2.3.3. Biological function of alginate in both producing bacterial species30-31
• 2.4. Effect of culture conditions on alginate production31-35
• 2.4.1. Carbon source32
• 2.4.2. p H condition32
• 2.4.3. Temperature32-33
• 2.4.4. Nitrogen source33
• 2.4.5. Effect of agitation33
• 2.4.6. Oxygen consumption33-35
• CHAPTER 3 BACTERIAL ALGINATE PRODUCTION AND EXTRACTION FROM AZOTOBACTER VINELANDII35-54
• 3.1. INTRODUCTION35-36
• 3.1.2. Aim35
• 3.1.3. Bacterial alginate production and extraction from Azotobacter vinelandii35-36
• 3.2. Materials and Methods36-38
• 3.2.1. Microorganism36
• 3.2.2. Materials36
• 3.2.3. Azotobacter vinelandii seed production culture media36
• 3.2.4. Sterilization and incubation of culture36-37
• 3.2.5. Inoculum preparation37
• 3.2.6. Bacterial alginate production media37
• 3.2.7. Bacterial alginate extraction37
• 3.2.8. Preparation of bacterial alginate for spectrophotometric determination37-38
• 3.2.9. Spectrophotometric condition for bacterial alginate determination38
• 3.3. Alginate standard curve construction38-42
• 3.3.1. Culture time for bacterial alginate production38
• 3.3.2. HPLC condition for alginate standard sample and bacterial alginate analysis38-39
• 3.3.3. Molecular weight determination of bacterial alginate from Azotobacter39
• 3.3.4. Hydrolysis of bacterial alginate for determining (G and M)39-40
• 3.3.5. Thin layer chromatography (TLC) condition40
• 3.3.6. Ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) condition40-41
• 3.3.7. Construction of guluronic / mannuronic (G and M) acid standard curve41
• 3.3.8. Results and discussion41
• 3.3.9. Bacterial alginate determination by spectrophotometric determination41-42
• 3.4. Alginate standard sample standard linear curve42-54
• 3.4.1. Result of incubation time experiment for bacterial alginate production42-44
• 3.4.2. Results of HPLC analysis of alginate standard sample & bacterial alginate44
• 3.4.3. Result of the relative molecular weight determination of bacterial alginate44-46
• 3.4.4. HPLC results of alginate standard sample & bacterial alginate sample after hydrolysis46-47
• 3.4.5. TLC result of standard sample of (G and M), alginate standard sample and the bacterial alginate sample after hydrolysis47-48
• 3.4.6. Results of UPLC-MS analysis of hydrolyzed bacterial alginate sample48-50
• 3.4.7. Construction of standard curves for β-D-mannuronic and α-L-guluronic acid50-51
• 3.4.8. Discussion51-53
• 3.4.9. Conclusion53-54
• CHAPTER 4 ELICITATION OF PHYTOCHEMICAL GLYCEOLLIN BY BACTERIAL ALGINATE EXTRACTED FROM AZOTOBACTER VINELANDII54-74
• 4.1. Introduction54-55
• 4.2. Experimental materials and methods55-56
• 4.2.1. Materials55
• 4.2.2. Chemicals55-56
• 4.2.3. Bacterial alginate elicitor produced by Azotobacter vinelandii56
• 4.3. Methods56-58
• 4.3.1. Elicitation activities56
• 4.3.2. Preparation of glyceollin for High performance liquid chromatography (HPLC) and Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC) analysis56-57
• 4.3.3. High performance liquid chromatography (HPLC) and ultra-performance liquid chromatography-57
• 4.3.4. Optimal condition activities57
• 4.3.5. Effect of elicitor’s concentration upon glyceollin accumulation57-58
• 4.3.6. Effect of temperature upon glyceollin accumulation58
• 4.3.7. Effect of moisture upon glyceollin accumulation58
• 4.3.8. Effect of soak time upon glyceollin accumulation58
• 4.3.9. Effect of time course upon glyceollin accumulation in soybean seeds58
• 4.4. Statistical Analysis58-59
• 4.5. Results59-70
• 4.5.1. Construction of linear curve for glyceollin61-62
• 4.5.2. Result of elicitor’s concentration effect upon glyceollin induction62-63
• 4.5.3. Result of temperature effect in the accumulation of glyceollin63
• 4.5.4. Result of moisture effect in the accumulation of glyceollin63-64
• 4.5.5. Result of soak time effect upon glyceollin accumulation64-65
• 4.5.6. Result of time course effect in the accumulation of glyceollin65-67
• 4.5.7. Quantitation of phytochemical glyceollins67-68
• 4.5.8. Results of UPLC-MS analysis of glyceollin elicited by bacterial alginate68-69
• 4.5.9. Result of electrospray ionization (ESI-MS) mass spectrometry69-70
• 4.6. Comparative results obtained for A. oryzae and bacterial alginate elicitors70-74
• CHAPTER 574-79
• 5.1. Comprehensive summary and discussion74-78
• 5.2. Conclusion and recommendation78-79
• REFERENCES79-91
• APPENDIX I91-92
• APPENDIX II92-93
• ACKNOWLEDGEMENT93-94
• RESUME94-96

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本文编号：857440