拟南芥AtCYSb相互作用蛋白的筛选及生物学功能研究

发布时间：2017-09-21 19:43

  本文关键词：拟南芥AtCYSb相互作用蛋白的筛选及生物学功能研究

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【摘要】：半胱氨酸蛋白酶抑制剂普遍存在于动物,植物和微生物体内,它在蛋白质水解,蛋白酶活性调节等许多生理过程中起着重要的作用。之前人们对半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究主要集中在抗病抗虫害方面,但是近些年来,人们逐渐发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物逆境防御过程中也起着重要的作用,因此探求和挖掘半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物逆境防御中的这种抗逆机理和潜在的作用对象具有十分重要的意义。AtCYSb是拟南芥中的一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,GUS染色结果表明AtCYSb在萌发的种子,年幼的叶,花药,种荚和成熟的叶,茎,种荚里均有表达,这表明它是植物生长周期里一个十分活跃的基因。另外前期的研究结果表明它可以受盐,碱和氧化等多种逆境胁迫的诱导表达,且在拟南芥中过量表达AtCYSb可以提高转基因拟南芥对盐,碱和氧化等逆境胁迫的耐受性,这说明AtCYSb在植物应对逆境胁迫的过程中起着重要的作用。为了探求和寻找AtCYSb转基因拟南芥植株的这种抗逆机理以及它潜在的作用对象,我们对其进行了酵母双杂交筛选并得到了一个与其具有相互作用的蛋白,钙离子依赖性的核酸酶AtCaN2,同时利用酵母共转化实验,体外pull-down实验和体内双分子荧光互补实验验证了AtCYSb与AtCaN2之间的相互作用。AtCaN2的酶活性检测实验表明,AtCaN2对双链DNA (dsDNA),单链DNA(ssDNA),环形质粒,rRNA,mRNA和tRNA等多种底物均具有降解能力,且AtCaN2降解RNA的速率快于DNA。除了钙离子之外,AtCaN2的酶活性还可以依赖镁离子和锰离子,以及钙离子+镁离子和钙离子+锰离子双离子条件,但是锌离子和金属螯合剂EDTA可以抑制AtCaN2的酶活性。点突变实验表明AtCaN2氨基酸序列中的天冬氨酸和精氨酸位点在保持其核酸酶活性上起着重要作用。UREA-PAGE实验结果表明AtCaN2是一种从3'端往5'端酶解的外切核酸酶。另外实验过程中还发现,AtCaN2的酶活性可以一定程度上被AtCYSb的抑制,这进一步说明了AtCYSb和AtCaN2之间存在着相互作用关系。AtCaN2的生物学功能研究表明,AtCaN2也可以受盐,碱,渗透和氧化等多种逆境胁迫诱导表达,同时GUS染色也显示AtCaN2在种子,花,茎,衰老的叶等多个时期和组织器官中有表达且逆境胁迫可以提高GUS的表达量,这说明AtCaN2基因也与逆境相关。另外在酵母里的功能研究表明过表达AtCaN2会导致酵母对盐胁迫的敏感性。在拟南芥里的功能研究表明过表达AtCaN2也会导致拟南芥对盐,碱和氧化等多种逆境胁迫的敏感性,而突变掉该基因则会提高植株对盐,碱和氧化等多种逆境胁迫的抗性,同时生理指标测定结果也表明,在逆境胁迫条件下,AtCaN2过表达植株更易受到逆境胁迫的伤害,导致其体内叶绿素更容易流失,并积累较高的丙二醛和活性氧含量,同时产生更多坏死的细胞,而AtCaN2突变体植株的这些指标则好于对照,这说明AtCaN2在植物逆境胁迫过程中起着负调控作用。此外,我们在探求AtCYSb抗逆机理及作用对象的同时还得到了它的一个相互作用蛋白60S核糖体蛋白(AtRP12C),酵母共转化,BiFC和Pull-down实验进一步验证了AtCYSb与AtRP12C蛋白之间的相互作用。我们对其进行了表达特性的初步研究,研究表明,AtRP12C基因在种子里的表达量比较高,在叶中的表达量较低,并且AtRP12C基因也可以受盐,碱,渗透和氧化等多种逆境胁迫诱导表达,说明AtRP12C也是一个与逆境相关的基因。
【关键词】：半胱氨酸蛋白酶抑制剂 钙离子依赖性核酸酶 酵母双杂交 60S核糖体蛋白 非生物逆境胁迫 核酸酶活性 拟南芥
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q946
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 绪论12-21
• 1.1 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂12-17
• 1.1.1 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抑制机制12-14
• 1.1.2 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂的生物学功能14-17
• 1.2 核酸酶17-20
• 1.2.1 核酸酶的分子量和结构特性17
• 1.2.2 核酸酶的温度等电点和pH条件17-18
• 1.2.3 核酸酶的金属离子和底物特异性18-20
• 1.3 本研究的目的和意义20-21
• 2 拟南芥AtCYSb与钙离子依赖性的核酸酶AtCaN2的相互作用研究21-42
• 2.1 材料和方法21-27
• 2.1.1 实验材料21-22
• 2.1.2 实验方法22-27
• 2.2 结果与分析27-41
• 2.2.1 拟南芥AtCYSb基因序列的生物信息学分析27-31
• 2.2.2 AtCYSb启动子表达特性研究31-36
• 2.2.3 AtCYSb蛋白的亚细胞定位分析36-37
• 2.2.4 AtCYSb与AtCaN2相互作用的验证37-41
• 2.3 本章小结41-42
• 3 钙离子依赖性核酸酶AtCaN2酶活特性分析42-64
• 3.1 材料和方法42-47
• 3.1.1 实验材料42-43
• 3.1.2 实验方法43-47
• 3.2 结果与分析47-63
• 3.2.1 His-AtCaN2蛋白的大量诱导和纯化47-49
• 3.2.2 His-AtCaN2点突变蛋白的大量诱导和纯化49-50
• 3.2.3 GST-AtCYSb蛋白的大量诱导和纯化50-51
• 3.2.4 核酸酶AtCaN2的酶活性分析51-58
• 3.2.5 AtCYSb对AtCaN2的酶活性的影响58-62
• 3.2.6 AtCaN2外切核酸酶特性的鉴定62-63
• 3.3 本章小结63-64
• 4 拟南芥钙离子依赖性核酸酶AtCaN2的生物学功能解析64-90
• 4.1 材料和方法64-67
• 4.1.1 实验材料64
• 4.1.2 实验方法64-67
• 4.2 结果与分析67-88
• 4.2.1 拟南芥AtCaN2基因序列的生物信息学分析67-71
• 4.2.2 AtCaN2表达特性研究71-76
• 4.2.3 AtCaN2蛋白的亚细胞定位分析76-77
• 4.2.4 AtCaN2基因在酵母中的功能分析77-79
• 4.2.5 AtCaN2转基因拟南芥的表型分析79-84
• 4.2.6 AtCaN2转基因拟南芥生理指标的测定84-88
• 4.3 本章小结88-90
• 5 AtCYSb与60S核糖体蛋白AtRP12C的相互作用研究90-104
• 5.1 材料和方法90-92
• 5.1.1 实验材料90
• 5.1.2 实验方法90-92
• 5.2 结果与分析92-103
• 5.2.1 拟南芥AtRP12C基因序列的生物信息学分析92-95
• 5.2.2 AtRP12C蛋白的亚细胞定位分析95
• 5.2.3 His-AtRP12C融合蛋白的诱导和纯化95-97
• 5.2.4 AtCYSb与AtRP12C相互作用的验证97-100
• 5.2.5 AtRP12C表达特性研究100-103
• 5.3 本章小结103-104
• 6 讨论104-108
• 6.1 AtCaN2的酶活特性分析104-105
• 6.2 AtCaN2在植物对逆境胁迫响应中发挥的作用105-106
• 6.3 AtCYSb与AtCaN2在逆境胁迫中的相互作用机制106-107
• 6.4 AtRP12C在逆境胁迫中的初步研究107
• 6.5 本论文的创新点107-108
• 结论108-109
• 参考文献109-126
• 攻读学位期间发表的学术论文126-127
• 致谢127-128

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1 郭坤元;拟南芥AtCYSb相互作用蛋白的筛选及生物学功能研究[D];东北林业大学;2015年

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本文编号：896505