大气压低温等离子体失活金黄色葡萄球菌及其机理研究

发布时间：2017-09-21 23:00

  本文关键词：大气压低温等离子体失活金黄色葡萄球菌及其机理研究

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【摘要】：大气压低温等离子体因其气体温度低、化学活性强、无污染,适合直接应用于热敏感型基质材料和人体组织等特点,广泛应用于工业生产中的多个领域。低温等离子体在形成过程中可产生一系列活性基团,近年来已开始应用于生产生活与生物医学中的灭菌消毒领域。科研工作者已开发出多种低温等离子体发生装置并研究了其对各种类型微生物的灭活效果及相关机理。但迄今为止的研究主要集中在物理层面,即将细菌本身作为一个“黑盒”,通过改变各种等离子体特性参数从外部探究细菌的失活原因,所得灭菌机制并不成熟。值得一提的是,从分子生物学层面尤其是微生物基因表达调控和质粒结构功能改变等角度进行的等离子体灭菌机理研究较少,相关信息匮乏。基于此,本论文一方面深入研究了大气压低温等离子体对不同生存状态下的金黄色葡萄球菌造成的失活效果和可能的作用机制,另一方面同时探索了等离子体处理使细菌在细胞和分子层面上可能发生的一系列结构和功能改变,旨在为低温等离子体灭菌技术和相关灭菌机理的完善提供帮助。 本文主要内容包括以下几个方面： 1.适用于生物医学应用的大气压低温等离子体源的研制及其特性参数诊断 a)正弦交流驱动的单电极惰性气体等离子体射流装置：交流高压电源驱动,根很细的铜棒充当高压电极,可产生接近室温(300K)的等离子体射流,接触人体皮肤表面时无灼热感,放电产生的活性基团可直接作用于靶点。 b)脉冲直流驱动的大气压空气中大面积多针放电等离子体装置：该装置以多根细铜棒作为电极阵列,通过限流电阻与高压直流电源相连,可在电极阵列与人体皮肤表面间形成大面积的接近室温的等离子体(290-300K),安全可靠,对皮肤无损伤。 c)上述两种低温等离子体源的放电参数测量。 d)通过发射光谱法、质谱法检测了该等离子体射流中各种含氧/氮活性组分(RONS)的存在,并获得等离子体射流中主要的代表性含氧/氮活性组分(包括多种中性粒子和正负离子等)在不同轴向位置的相对发射强度。其发射强度随着检测距离的改变发生变化,喷口下方5mm处上述活性组分的发射强度基本上比10mm处要高。 e)通过发射光谱法检测了该空气放电等离子体中一系列含氧/氮活性组分的相对发射强度。通过光谱分析发现300-450m和600-800m处出现最强烈的发射峰,分别对应于N2的第二正系(N2(C-B))和N2的第二正系的二次发射(second order emission),同时检测到200-300m处的NO,系统的发射谱带(NO(A-X)),以及777.2nm和844.6nm处的活性原子氧(O)谱带。 f)利用分光光度计检测了不同剂量空气放电等离子体处理后的细菌悬液中,代表性的长寿命活性组分H2O2, O3, NO2-, NO3’的浓度变化。 g)通过紫外吸收法检测了该空气放电等离子体产生臭氧的浓度(约507ppm)。 2.大气压氦气等离子体射流处理失活金黄色葡萄球菌生物膜的相关研究 采用不同剂量(时间)的大气压氦气等离子体射流处理金黄色葡萄球菌生物膜。处理10mm后,生物膜中菌量降低了3log10以上,且微生物膜中细菌相较于贴壁的同类细菌对等离子体的抗性强。刃天青(Resazurin)检测显示大约70%的微生物膜中细菌失去新陈代谢能力,同时大约30%的细菌进入一种存活但不能培养生长(VBNC)状态。扫描电子显微镜(SEM)照片说明等离子体在处理微生物膜时首先侵蚀其细胞外多聚基质(EPS),然后攻击细菌外部结构,最终导致微生物膜表面若干层细菌的结构崩溃。SYTO9/PI染色的激光共聚焦显微镜(CLSM)照片说明等离子体处理10min后约69%的生物膜中细菌失去完整的细胞膜结构,基于细胞膜结构完整性的等离子体作用深度约为12.4μm(5min处理)；2,7-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-D A)染色的生物膜CLSM照片显示了等离子体处理造成的与生物膜深度(层)相关的细菌内活性含氧基团(ROS)的积累,以ROS积累效果为标识的等离子体作用深度约12.0μm。实验结果说明等离子体处理可能导致细菌内ROS的生成,诱导菌内氧化压力上升,当超过细菌氧化应激反应阈值时造成细菌失活。 3.大气压空气中多针放电等离子体处理对悬浮的金黄色葡萄球菌基因表达调控的影响 采用定量实时聚合酶链式反应技术(q-rt-PCR)分析金黄色葡萄球菌在应对不同剂量等离子体处理时,细菌中对抗环境压力胁迫的相关基因的转录水平动态表达调控。实验结果说明等离子体处理可能会影响细菌中与氧化应激反应,生物膜形成,抗生素抵抗和DNA损伤保护／修复相关的基因表达。等离子体放电产生的(气相)以及诱导细菌悬液中产生的(液相)含氧／氮活性组分可能是造成上述变化的主要原因。 4.大气压空气中多针放电等离子体处理对悬浮的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌 质粒结构的影响 等离子体处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌后,提取出质粒进行DNA琼脂糖凝胶电泳检测。实验结果显示,随着等离子体处理剂量的增加,具超螺旋(super-coil)、开环(open-circle)和线状(linear)结构的质粒DNA浓度逐渐降低,说明细菌质粒DNA结构逐渐被破坏。从侧面证明大剂量等离子体处理可破坏细菌遗传信息,彻底杀灭悬浮细菌。等离子体放电在气相中产生的以及在气液交界相和液相中通过等离子体化学反应诱导产生的含氧/氮活性组分可能是导致细菌质粒结构破坏的主要原因。
【关键词】：低温等离子体 等离子体诊断 金黄色葡萄球菌 灭菌/消毒 活性含氧/氮基团
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O536
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 第1章 绪论15-39
• 1.1 等离子体15-16
• 1.2 低温等离子体16-18
• 1.3 低温等离子体组分18-19
• 1.4 低温等离子体灭菌19-28
• 1.5 等离子体灭菌机理28-29
• 1.6 本文主要研究内容29-30
• 1.6.1 开题目的与意义29-30
• 1.6.2 课题主要研究内容30
• 参考文献30-39
• 第2章 大气压低温等离子体装置的研制与诊断39-69
• 2.1 大气压低温等离子体射流39-51
• 2.1.1 装置结构39-41
• 2.1.2 放电参数41-43
• 2.1.3 物理特性诊断43-51
• 2.2 大气压空气放电等离子体51-61
• 2.2.1 装置结构51-52
• 2.2.2 放电参数52-53
• 2.2.3 光谱诊断53-54
• 2.2.4 液相中活性基团54-59
• 2.2.5 臭氧浓度59-61
• 2.3 本章小结61-63
• 参考文献63-69
• 第3章 大气压低温等离子体射流失活金黄色葡萄球菌微生物膜的相关研究69-103
• 3.1 研究背景69-72
• 3.1.1 金黄色葡萄球菌简介69-70
• 3.1.2 细菌微生物膜70-71
• 3.1.3 微生物膜与耐药性71
• 3.1.4 微生物膜与持续性感染71-72
• 3.2 研究意义72-73
• 3.3 等离子体射流失活金黄色葡萄球菌微生物膜的效果研究73-79
• 3.3.1 研究方法73
• 3.3.2 试剂与仪器73-74
• 3.3.3 实验步骤74-76
• 3.3.4 实验结果与分析76-79
• 3.4 等离子体射流失活金黄色葡萄球菌微生物膜的机理研究79-95
• 3.4.1 等离子体处理对生物膜菌细胞膜结构的影响79-87
• 3.4.2 等离子体处理对生物膜菌新陈代谢能力的影响87-89
• 3.4.3 等离子体处理对生物膜菌内活性含氧基团(ROS)浓度的影响89-93
• 3.4.4 等离子体处理对细菌生物膜表面形貌的影响93-95
• 3.4.5 等离子体失活细菌生物膜的机理推测95
• 3.5 本章小结95-96
• 参考文献96-103
• 第4章 大气压空气等离子体对金黄色葡萄球菌基因表达的影响效果研究103-123
• 4.1 研究背景103-108
• 4.1.1 细菌氧化应激反应相关基因103-105
• 4.1.2 葡萄球菌微生物膜形成相关基因105-107
• 4.1.3 细菌耐药性相关基因107-108
• 4.1.4 细菌DNA损伤/修复相关基因108
• 4.2 研究方法108-110
• 4.3 试剂及仪器110
• 4.4 实验步骤110-111
• 4.5 实验结果及分析111-116
• 4.5.1 细菌氧化应激反应相关基因的表达改变111-112
• 4.5.2 葡萄球菌生物膜形成相关基因的表达改变112-114
• 4.5.3 细菌耐药性相关基因的表达改变114-115
• 4.5.4 细菌DNA损伤/修复相关基因的表达改变115-116
• 4.6 本章小结116-117
• 参考文献117-123
• 第5章 大气压空气放电等离子体对细菌质粒DNA结构影响效果研究123-137
• 5.1 研究背景123-125
• 5.1.1 质粒123-125
• 5.1.2 等离子体对裸露质粒的作用效果125
• 5.2 等离子体对细菌中质粒的作用效果研究125-127
• 5.2.1 研究方法125
• 5.2.2 试剂与仪器125-126
• 5.2.3 实验步骤126-127
• 5.3 实验结果与分析127-132
• 5.3.1 金黄色葡萄球菌中质粒结构变化情况127-130
• 5.3.2 大肠杆菌中质粒结构变化情况130-132
• 5.4 本章小结132-133
• 参考文献133-137
• 第6章 论文总结与展望137-143
• 6.1 论文总结137-140
• 6.2 研究展望140-141
• 6.3 本文创新点141-143
• 致谢143-145
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果145

【参考文献】

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本文编号：897337