反式作用小分子干扰RNA基因TAS3α的功能调控元件分析及优化

发布时间：2017-09-22 03:25

  本文关键词：反式作用小分子干扰RNA基因TAS3α的功能调控元件分析及优化

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【摘要】：人工微小RNA (artificial microRNA)和合成反式作用小分子干扰RNAs (syn-tasiRNAs)在植物基因功能研究中已经得到了广泛应用。一个TAS基因可以同时产生多个tasiRNAs,因而TAS基因具有同时干扰多个靶基因的应用前景,然而,其干扰效果仍不尽人意。本研究通过对拟南芥TAS3a产生tasiRNAs的限制性因子进行分析,得到了优化的TAS3a基因,且其对靶基因的干扰效果明显,此结果在植物基因功能研究中具有一定的应用价值。 基于我们建立的XVE诱导性多基因表达系统,分析了miR390, AGO7, DRB4和SGS3四个作用因子对TAS3a产生有效tasiRNA的影响。结果显示,与诱导表达AGO7, DRB4和SGS3相比,只有当诱导表达miR390a时,产生于TAS3a的沉默报告子syn-tasiRNA/PDS对靶基因PDS的干扰效果明显增强。另外,随着诱导时间的增加,成熟miR390的表达量逐渐增加,相应地,沉默报告子syn-tasiRNA/PDS的表达量逐渐增加,而靶基因PDS mRNA的表达量逐渐下降。这表明了miR390是TAS3a产生有效tasiRNAs的限制性因素。 提高tasiRNAs的表达量及其生成的同步性(in-phase)是增强tasiRNAs有效性的两个重要因素。TAS3a基因产生tasiRNA的区域(两个miR390靶位点间)越长,其产生非同步性的无效tasiRNAs的几率越高,造成脱靶效应这样的负效应将越严重。为了减少非同步性tasiRNAs引起的脱靶效应,将TAS3a基因进行截短,获得截短型TAS3a基因。对其进行功能分析发现,与全长型TAS3a基因相比,截短型TAS3a基因可以更有效地干扰靶基因PDS的表达。 基于以上研究,在截短型TAS3a基因的内含子中插入miR390a基因,得到优化的TAS3a基因-截短型TAS3a-miR390a两融合基因。对其进行功能分析发现,诱导表达截短型TAS3a-miR390a两融合基因和截短型TAS3a时,前者产生的沉默报告子syn-tasiR/PDS对靶基因PDS的干扰效果明显好于后者。另外,超表达TAS3a-miR390a两融合基因对TCP家族的多个成员也有较理想的干扰效果。这些研究结果表明,TAS3a-miR390a两融合基因作为优化的TAS3a基因可以更有效地干扰单个或多个目标基因的表达。 TAS3a的两个miR390靶位点间的区域越短,特异性越好,但过短的TAS3a基因可能会影响syn-tasiRNA的产生。构建了一系列截短型TAS3a-miR390a两融合基因,对其产生有效tasiRNAs的最短间距进行分析,发现与野生型相比,当两个miR390靶位点间的区域最短截短到可以产生一个21nt tasiRNAs时,沉默报告子对靶基因PDS没有明显的干扰效果。当两个miR390靶位点间的区域最短截短到可以产生两个21nt tasiRNAs时,沉默报告子对靶基因PDS有明显的干扰效果。这表明TAS3a基因的两个miR390靶位点间的最短间距为能容纳两个21nt tasiRNAs的长度。 为了产生更多有效的syn-tasiRNAs,尝试使用miR173靶点替代TAS3a的3'-miR390靶点,将miR390a基因和miR173基因融合并插入到TAS3a基因的内含子中,得到：TAS3a, TAS1c, miR390a和miR173四基因融合体。在四基因融合体中,TAS3a和TAS1c的syn-tasiRNAs产生区域分别位于miR390靶点与miR173靶点间和miR173靶点后面。对其进行功能验证,结果显示位于miR173靶点后面的沉默报告子对靶基因有强的干扰效果,表明TAS3a和TAS1c融合后可以按照各自的机制产生有效的syn-tasiRNAs,并且四基因融合体可用于同时干扰多个基因的表达。同时,也验证了TAS3a产生有效tasiRNAs的最短间距是两个21nt tasiRNA的长度。 总之,通过对TAS3a产生有效tasiRNAs的影响因素进行分析,发现miR390是其限制性因素,TAS3a产生有效syn-tasiRNA的区域长度至少能够容纳2个syn-tasiRNAs。在此基础上得到了优化的TAS3a基因,包括TAS3a-miR390a两融合基因和TAS3a-TAS1c-miR390a-miR173四基因融合体,可以为影响植物生长发育,种子萌发,以及致死的基因的功能研究提供干扰手段。
【关键词】：TAS3α syn-tasiRNA miR390 基因干扰 融合基因
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• ~.略词8-12
• 第一章 文献综述12-30
• 1.1 小RNA参与的基因沉默12
• 1.2 miRNA和siRNA的产生及功能研究12-15
• 1.2.1 miRNA的产生与功能研究13-14
• 1.2.2 siRNA的产生与功能研究14-15
• 1.3 小RNA介导的基因沉默机制15-17
• 1.3.1 小RNA介导的基因沉默方式15-16
• 1.3.2 小RNA对目标mRNA的作用16-17
• 1.4 小RNA的基因干扰应用17-20
• 1.4.1 siRNA的基因干扰应用17-18
• 1.4.2 人工miRNA(amiRNA)的干扰应用18
• 1.4.3 基因沉默的特异性18-19
• 1.4.4 基因沉默的系统效应19-20
• 1.5 TAS基因的功能研究及应用20-29
• 1.5.1 TAS基因的定义与分类20-21
• 1.5.2 具有单个miRNA靶位点的TAS1/2/4基因21-24
• 1.5.3 具有双miRNA靶位点的TAS3基因24-26
• 1.5.4 TAS通路中的相关蛋白质26-28
• 1.5.5 syn-tasiRNAs的基因干扰应用28-29
• 1.6 本研究的目的和意义29-30
• 第二章 实验材料与方法30-52
• 2.1 实验材料30-32
• 2.1.1 菌株与质粒30
• 2.1.2 常用分子生物学试剂及耗材30
• 2.1.3 植物材料30
• 2.1.4 常用培养基的配制30-31
• 2.1.5 常用抗生素的配制31
• 2.1.6 实验溶液的配制31-32
• 2.2 实验方法32-52
• 2.2.1 载体构建方法32-37
• 2.2.2 植物多基因表达载体构建方法37-38
• 2.2.3 植物材料培养方法38-39
• 2.2.4 植物材料检测方法39-45
• 2.2.5 植物表达载体的构建流程45-52
• 第三章 实验结果与分析52-98
• 3.1 miR390对TAS3a产生有效tasiRNAs的影响分析52-58
• 3.2 AG07对TAS3a产生有效tasiRNAs的影响分析58-61
• 3.3 DRB4对TAS3a产生有效tasiRNAs的影响分析61-64
• 3.4 SGS3对TAS3a产生有效tasiRNAs的影响分析64-67
• 3.5 截短型TAS3a可以有效干扰目标基因的表达67-74
• 3.6 TAS3a-miR390a两融合基因的功能分析74-80
• 3.7 TAS3a-miR390a融合基因对单基因和多基因的干扰应用80-86
• 3.8 TAS3a两个miR390靶位点之间的最短间距分析86-90
• 3.9 TAS3a,TAS1c,miR390a和miR173四基因融合体可以干扰基因表达90-93
• 3.10 截短型四基因融合体可以干扰多基因93-98
• 第四章 讨论98-104
• 4.1 本研究的应用价值98
• 4.2 miR390是TAS3a超表达产生有效tasiRNAs的限制性因子98-99
• 4.3 TAS3a tasiRNAs产生区域的最短距离为产生2个21 nt tasiRNA的长度99-100
• 4.4 miR390a可以在TAS3a的内含子中进行表达100-101
• 4.5 tasiRNAs本身的序列特征对TAS3a产生有效tasiRNAs的影响101
• 4.6 TAS3a,TAS1c,miR390a和miR173四融合基因对多个靶基因有干扰效果101-104
• 第五章 结论与展望104-106
• 附录一 Crispr/Cas9系列载体在拟南芥多基因突变体中的应用106-116
• 2.1 研究背景106
• 2.2 本研究的目的和意义106-107
• 2.3 实验材料107
• 2.4 实验方法107
• 2.5 实验结果与分析107-114
• 2.5.1 包含Crispr-Cas9表达框的双元表达载体构建107
• 2.5.2 T1代转基因拟南芥的突变分析107-110
• 2.5.3 T2代转基因拟南芥的突变分析110-114
• 2.6 结论与讨论114-116
• 附录二 文章中所需引物序列116-122
• 参考文献122-132
• 致谢132-133
• 个人简历133

【共引文献】

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5 Tianzhi Huang;Angel Alvarez;Bo Hu;Shi-Yuan Cheng;;Noncoding RNAs in cancer and cancer stem cells[J];Chinese Journal of Cancer;2013年11期

6 Wenwen Jia;Wen Chen;Jiuhong Kang;;The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

7 安丽娜;董斐斐;王国坤;单冬凯;荆清;;MicroRNA与动脉粥样硬化[J];国际心血管病杂志;2013年04期

8 冯楠楠;孙品;夏昭林;;凋亡相关的microRNA分子研究进展[J];工业卫生与职业病;2013年05期

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本文编号：898523