鸡毒支原体MGA_0676蛋白诱导细胞凋亡分子机制研究

发布时间：2017-09-23 13:20

  本文关键词：鸡毒支原体MGA_0676蛋白诱导细胞凋亡分子机制研究

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【摘要】：鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,M. gallisepticum)是引起鸡呼吸困难、气囊炎等症状的慢性呼吸道疾病的病原体,其诱导的细胞凋亡与其致病机制密切相关。支原体核酸酶样蛋白是支原体重要的毒力蛋白,在其诱导细胞捌亡的过程中发挥重要作用。因此,研究鸡毒支原体核酸酶样蛋白对鸡毒支原体的致病机制研究及鸡毒支原体病的防控具有重要意义。 本研究将鸡毒支原体MGA0676蛋白进行序列分析及原核表达后,通过核酸酶切试验及酶谱试验对其核酸酶活性进行鉴定,结果发现MGA0676蛋白具有一个链球菌耐热核酸酶(staphylococcal nuclease,SNC)功能区,原核表达的rMGA_0676蛋白可以降解质粒DNA、单链DNA及宿主细胞的核酸底物,具有Ca2+依赖性,在37℃及49℃具有较好的酶切活性,缺失SNC区的rMGA_0676△SNC蛋白不能降解核酸底物,这表明MGA0676蛋白是鸡毒支原体具有Ca2+依赖性耐热核酸酶,其核酸酶功能区为SNC区域。为研究MGA0676蛋白的生物学特性,利用膜蛋白免疫印迹及免疫胶体金电镜技术鉴定其膜相关性,采用细胞Annexin V/PI方法及流式细胞术检测体外MGA0676蛋白诱导鸡胚细胞(DF-1)凋亡情况,采用激光共聚焦观察MGA0676蛋白在细胞上的定位进行观察,同时采用HE、IHC及TUNEL方法对rMGA_0676蛋白处理后雏鸡的组织病理变化进行分析,并对SNC区域的功能进行鉴定；结果发现MGA0676存在于鸡毒支原体的膜蛋白中,分布于鸡毒支原体膜表面,随着rMGA_0676浓度(0.1μM、0.25μM、0.5μM)的增加及MGA0676蛋白在宿主细胞内表达时间(12h、24h、36h)的增长,MGA0676蛋白诱导细胞凋亡的量显著性增加(p0.01),体内试验发现rMGA_0676可以定位于雏鸡气管、肺、胸腺、脾脏及法氏囊组织并导致组织发生病变,诱导细胞凋亡,同时发现其存在于DF-1细胞核周围及细胞核,缺失了SNC功能区的MGA0676蛋白不能诱导DF-1细胞凋亡,可以内化进入细胞,但不能进入细胞核,上述结果表明MGA0676蛋白是鸡毒支原体一个膜相关的蛋白质,定位于鸡毒支原体的细胞表面,具有内化及诱导细胞凋亡的功能,其诱导细胞凋亡功能区为SNC区,该区域影响MGA0676蛋白进入细胞核,但不影响其内化细胞。为进一步研究MGA0676蛋白内化细胞的特性及致病机理,采用间接免疫荧光及激光共聚焦技术对MGA0676内化细胞的机理进行研究,并对MGA0676蛋白的细胞靶蛋白采用pulldown、质谱测序、免疫共沉淀及激光共聚焦技术进行研究,结果发现抑制Caveolin细胞内吞途径,抑制了rMGA_0676蛋白内化DF-1细胞,鸡毒支原体MGA0676蛋白与鸡DF-1细胞的NEDD8激活酶调节亚基(NEDD8-activating enzyme E1regulatory subunit,NAE)蛋白相互作用,缺失了MGA0676蛋白的SNC区域或NAE蛋白的Thif区域均阻止了MGA0676蛋白与NAE蛋白的相互作用,这表明毒支原体MGA0676蛋白通过依赖于Caveolin的细胞内吞作用进入细胞,其SNC区域与鸡DF-1细胞的NAE蛋白的Thif区域相互作用。为进一步研究MGA0676蛋白与宿主NAE蛋白相互作用所引起的生物学效应与细胞凋亡的关系,采用小RNA干扰抑制DF-1细胞内源性的NAE蛋白的表达,证实MGA0676与其的相互作用对细胞凋亡的影响,并通过检测细胞内NF-κB活性,研究DF-1细胞NF-κB的激活与rMGA0676诱导细胞凋亡的关系,结果发现,抑制DF-1细胞NAE表达阻止了rMGA_0676蛋白及鸡毒支原体诱导的细胞凋亡,rMGA_0676蛋白可以激活宿主细胞NF-κB信号途径,阻断MGA0676与NAE相互作用抑制了rMGA_0676蛋白诱导的NF-κB的激活,抑制细胞内源性的NF-κB,抑制了rMGA_0676蛋白诱导的细胞凋亡,这表明鸡毒支原体MGA0676蛋白与DF-1细胞NAE蛋白相互作用激活宿主细胞NF-κB信号通路,诱导细胞凋亡。 本研究证实了鸡毒支原体MGA0676蛋白是鸡毒支原体一个膜相关的核酸酶蛋白,揭示了MGA0676蛋白引起的宿主细胞凋亡的分子致病机理,阐明了NAE及NF-κB在鸡毒支原体MGA-0676蛋白在引起细胞凋亡中发挥的作用,为深入探讨鸡毒支原体引起的细胞凋亡的分子致病机理提供了重要的理论依据。
【关键词】：鸡毒支原体 MGA_0676 细胞凋亡 NEDD8激活酶 NF-κB
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.62
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 第一章 文献综述16-26
• 1.1 鸡毒支原体病研究进展16-21
• 1.1.1 鸡毒支原体病原学16-17
• 1.1.2 鸡毒支原体流行病学17
• 1.1.3 鸡毒支原体病的临床症状与病理变化17-18
• 1.1.4 鸡毒支原体病的诊断18-19
• 1.1.5 鸡毒支原体病的防治19-21
• 1.2 鸡毒支原体致病机理21-22
• 1.2.1 鸡毒支原体的病理反应21
• 1.2.2 鸡毒支原体的致病性21-22
• 1.2.3 鸡毒支原体的免疫损伤机理22
• 1.2.4 鸡毒支原体感染与细胞凋亡22
• 1.3 支原体与细胞凋亡研究进展22-24
• 1.3.1 支原体诱导的细胞凋亡22-23
• 1.3.2 宿主NF-κB信号通路与支原体诱导的细胞凋亡23-24
• 1.4 病原微生物核酸酶蛋白的研究进展24-25
• 1.5 本研究目的和意义25-26
• 第二章 鸡毒支原体MGA_0676原核表达及其性质鉴定研究26-51
• 2.1 引言26
• 2.2 材料和方法26-41
• 2.2.1 鸡毒支原体26
• 2.2.2 载体及菌株26
• 2.2.3 主要试剂及酶26
• 2.2.4 主要溶剂及其配制26-29
• 2.2.5 主要仪器设备29
• 2.2.6 鸡毒支原体的培养29
• 2.2.7 鸡毒支原体基因组DNA提取29-30
• 2.2.8 MGA_0676基因的扩增与定点突变30-32
• 2.2.9 MGA_0676蛋白结构分析预测32-33
• 2.2.10 pET-28a-MGA_0676及pET-28a-MGA_0676~(△SNC)的构建33-35
• 2.2.11 重组蛋白的诱导表达与纯化35-37
• 2.2.12 重组蛋白浓度测定37
• 2.2.13 重组蛋白的免疫印迹鉴定37-38
• 2.2.14 重组蛋白性质的鉴定38-40
• 2.2.15 本章节技术路线40-41
• 2.3 结果41-49
• 2.3.0 MGA_0676基因的克隆及其点突变结果41
• 2.3.1 MGA_0676蛋白结构分析41-43
• 2.3.2 pET-28a-MGA_0676和pET-28a-MGA_0676~(△SNC)载体的构建及鉴定43-44
• 2.3.3 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析44-45
• 2.3.4 重组蛋白的纯化与鉴定45-46
• 2.3.5 蛋白定量标准曲线的绘制46-47
• 2.3.6 MGA_0676蛋白核酸酶活性检测47-49
• 2.4 讨论49-50
• 2.5 小结50-51
• 第三章 鸡毒支原体MGA_0676蛋白诱导细胞凋亡及内化细胞研究51-76
• 3.1 引言51
• 3.2 材料和方法51-64
• 3.2.1 试验材料51-54
• 3.2.2 试验方法54-64
• 3.3 结果64-74
• 3.3.1 MGA_0676及其突变体(MGA_0676~(△SNC))真核表达载体构建64-65
• 3.3.2 MGA_0676是鸡毒支原体膜相关的脂蛋白65-66
• 3.3.3 MGA_0676体外诱导DF-1细胞凋亡66-68
• 3.3.4 MGA_0676体内诱导DF-1细胞凋产68-69
• 3.3.5 MGA_0676功能区SNC区域是诱导细胞凋亡的活性区69-71
• 3.3.6 MGA_0676功能区SNC区域是其核定位的重要区域71-72
• 3.3.7 MGA_0676内化及诱导哺乳动物细胞凋亡72-74
• 3.4 讨论74-75
• 3.5 小结75-76
• 第四章 鸡毒支原体MGA_0676内化细胞机理研究76-88
• 4.1 引言76
• 4.2 材料和方法76-81
• 4.2.1 试验材料76-77
• 4.2.2 试验方法77-81
• 4.3 结果81-86
• 4.3.1 MGA_0676蛋白内化细胞具有剂量依赖性与时间依赖性81-82
• 4.3.2 Caveolin抑制剂Filipin对MGA_0676蛋白内化细胞影响82-83
• 4.3.3 激光共聚焦观察抑制剂对MGA_0676蛋白内化细胞的影响83-84
• 4.3.4 小干扰RNA抑制Caveolin途径影响MGA_0676蛋白内化细胞84-85
• 4.3.5 MGA_0676蛋白与Caveolin在DF-1细胞内共定位85-86
• 4.4 讨论86-87
• 4.5 小结87-88
• 第五章 鸡毒支原体MGA_0676蛋白与DF-1细胞相互作用研究88-105
• 5.1 引言88
• 5.2 材料和方法88-96
• 5.2.1 试验材料88-90
• 5.2.2 试验方法90-96
• 5.3 结果96-103
• 5.3.1 pulldown筛选与MGA_0676相互作用的DF-1细胞蛋白96
• 5.3.2 生物信息学分析MGA_0676与宿主细胞蛋白相互作用96-97
• 5.3.3 NAE基因RT-PCR扩增及其载体构建97-98
• 5.3.4 原核表达及纯化NAE98-99
• 5.3.5 免疫印迹检测NAE高免血清99
• 5.3.6 免疫共沉淀验证MGA_0676蛋白与细胞NAE蛋白相互作用99-100
• 5.3.7 激光共聚焦显微镜观察MGA_0676和NAE在细胞中共定位100-102
• 5.3.8 MGA_0676蛋白SNC区域与NAE蛋白的Thif区域相互作用102-103
• 5.4 讨论103-104
• 5.5 小结104-105
• 第六章 鸡毒支原体MGA_0676与NAE相互作用对细胞凋亡的影响105-112
• 6.1 引言105
• 6.2 材料和方法105-108
• 6.2.1 试验材料105-106
• 6.2.2 试验方法106-108
• 6.3 结果108-111
• 6.3.1 筛选最优的抑制DF-1细胞NAE表达的小干扰RNA序列108
• 6.3.2 细胞NAE表达抑制对MGA_0676及鸡毒支原体诱导细胞病变影响108-109
• 6.3.3 细胞NAE表达抑制对MGA_0676及鸡毒支原体诱导细胞凋亡影响109-111
• 6.4 讨论111
• 6.5 小结111-112
• 第七章 鸡毒支原体MGA_0676蛋白激活NF-κB诱导细胞凋亡作用机制112-127
• 7.1 引言112
• 7.2 材料和方法112-118
• 7.2.1 试验材料112-113
• 7.2.2 试验方法113-118
• 7.3 结果118-125
• 7.3.1 MGA_0676蛋白激活DF-1细胞NF-κB118-120
• 7.3.2 鸡毒支原体激活DF-1细胞NF-κB120-121
• 7.3.3 免疫印迹检测MGA_0676与NAE相互作用激活DF-1细胞NF-κB121
• 7.3.4 激光共聚焦检测MGA_0676与NAE互作对DF-1细胞Rela的转位121-123
• 7.3.5 免疫印迹检测DF-1细胞Rela干扰结果123
• 7.3.6 NF-κB激活对MGA_0676蛋白诱导细胞凋亡影响123-125
• 7.4 讨论125
• 7.5 小结125-127
• 第八章 结论127-128
• 第九章 创新点128-129
• 参考文献129-139
• 致谢139-140
• 作者简历140

【参考文献】

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1 陈凤梅,牛钟相,程光民,王勇;鸡毒支原体研究进展[J];动物医学进展;2004年03期

2 秦璐璐;;鸡毒支原体PCR检测方法的建立[J];动物医学进展;2009年02期

3 孔意端;陈峰;廖理克;廖秋生;覃健萍;;广东地区鸡毒支原体血清学调查[J];广东畜牧兽医科技;2010年01期

4 毛晓娜;王嵩林;徐丽丽;周莉;姚琦;张映;;以鸡毒支原体pvpA基因序列建立的套式PCR检测方法[J];中国畜牧兽医;2011年07期

5 邓显文,谢芝勋,刘加波,庞耀珊,谢志勤,韦启高,邓小明,廖欣雪;广西鸡毒支原体血清学调查[J];广西畜牧兽医;1999年01期

6 李慕瑶;沈青春;刘羿均;杨慧;马会籽;戚麟;孙晔;;鸡毒支原体培养基的选择及其效果评价[J];当代畜牧;2014年27期

7 刘月凤;;鸡毒支原体诊断研究新进展[J];陕西农业科学;2011年01期

8 贾丽艳;逯晓敏;张映;;两步PCR法检测鸡新城疫疫苗中鸡毒支原体污染的研究[J];山西农业大学学报(自然科学版);2008年03期

9 齐新永;张维谊;徐锋;沈莉萍;宁昆;王建;李凯航;周锦萍;刘佩红;;上海地区鸡毒支原体感染抗体的血清学调查[J];上海畜牧兽医通讯;2014年03期

10 杨百亮,赵翠萍,刘田生,李天俊;应用单克隆抗体AC-ELISA检测鸡蛋卵黄中鸡毒支原体[J];中国预防兽医学报;2001年01期

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