枯草芽孢杆菌核糖体大亚基组装过程的研究

发布时间：2017-09-28 03:14

  本文关键词：枯草芽孢杆菌核糖体大亚基组装过程的研究

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【摘要】：核糖体是细胞体内负责蛋白质合成的细胞器,由大亚基和小亚基组成。每个亚基都是由一到两条长链rRNA和一系列核糖体蛋白质组成的核糖核蛋白复合物。核糖体的组装是细胞体内所有代谢活动的基础,其组装的效率和准确性受到严格的细胞调控。核糖体组装由很多不同的组装事件组成,包括rRNA的折叠和核糖体蛋白质结合。在体内,这个过程有很多组装因子的参与。这些组装因子的敲除或缺失会严重影响核糖体的成熟过程,导致细胞体内组装中间体的积累。组装因子YlqF是一种GTPase,参与枯草芽孢杆菌大亚基的组装过程。YlqF的缺失会导致50S大亚基前体45S的积累。本文中,我们利用定量质谱和冷冻电镜三维重构的方法对45S组装中间体的蛋白质组成和23S rRNA的构象状态进行分析。通过定量质谱分析,我们发现45S中核糖体蛋白L28、L16、L33、L36和L35有非常严重的缺失。这种蛋白质缺失模式与其他一些由于基因缺陷导致的50S大亚基前体的蛋白质缺失模式非常类似,说明在50S亚基组装后期有一个非常保守的限速步骤。冷冻电镜结构分析发现45S核糖体包含有两种构象状态的组装中间体,State I和State II。这两种构象状态蛋白质缺失情况比较类似,且与定量质谱结果一致。两种构象状态的一些重要的功能区域都没有正确组装,如肽基转移酶活性中心以及与小亚基的接触面,因此都无法与tRNA以及小亚基结合。两者的差别主要在CP和H38的成熟情况。State II中,CP高度不稳定,H38位置发生了很大的偏转,与L7/L12 stalk形成了非自然状态的相互作用;State I中,CP与H38已经相互稳定下来,H38的构象类似于成熟状态。通过对以上数据分析,我们构建了50S大亚基体内组装后期的一条组装通路:这条通路主要由两部分组成,State II到State I的转变以及State I到成熟50S的转变。State II到State I主要是23S rRNA构象的成熟,H38的重定向是一个关键的限速步骤;而State I到成熟50S的转变主要是缺失的核糖体蛋白质的结合。本文中我们还对YlqF与大亚基的相互作用进行了研究。分别用体内和体外装配的方式获得YlqF与成熟50S或45S的复合物,进行冷冻电镜结构解析。结构信息表明,YlqF的作用位点都位于23S rRNA上,尤其是H38/CP区域。因此YlqF很可能是作为一个rRNA分子伴侣,促进H38和CP的正确折叠。
【关键词】：核糖体 组装因子 YlqF 核糖体组装中间体 冷冻电镜
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q933
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 第1章 引言10-40
• 1.1 核糖体的结构与功能10-17
• 1.1.1 核糖体的结构10-14
• 1.1.2 核糖体的功能：蛋白质的翻译过程14-17
• 1.2 核糖体组装过程的研究17-29
• 1.2.1 核糖体体外组装过程的研究18-20
• 1.2.2 核糖体体内组装过程的研究20-22
• 1.2.3 核糖体体内组装与体外组装的比较22-23
• 1.2.4 组装因子在核糖体体内组装过程中的作用23-29
• 1.3 冷冻电镜技术及其在核糖体组装过程研究中的应用29-34
• 1.3.1 电子显微镜成像29-30
• 1.3.2 冷冻电镜技术的主要方法30-31
• 1.3.3 冷冻电镜技术的发展31-32
• 1.3.4 冷冻电镜技术在核糖体组装过程研究中的应用32-34
• 1.4 枯草芽孢杆菌 50S亚基组装因子YlqF研究进展34-36
• 1.5 本课题研究内容及研究意义36-40
• 1.5.1 本课题的主要研究内容36-37
• 1.5.2 本课题研究的理论意义37
• 1.5.3 本课题研究的应用价值37-40
• 第2章 枯草芽孢杆菌 50S大亚基组装中间体的研究40-91
• 2.1 引言40
• 2.2 主要实验仪器40-41
• 2.3 实验材料与方法-成熟 50S亚基部分41-53
• 2.3.1 枯草芽孢杆菌成熟 50S亚基的纯化41-43
• 2.3.2 冷冻电镜样品制备43-45
• 2.3.3 冷冻电镜数据收集45-48
• 2.3.4 冷冻电镜数据处理48-52
• 2.3.5 搭建原子模型52-53
• 2.4 实验材料与方法- 45S组装中间体部分53-60
• 2.4.1 45S组装中间体的纯化53-55
• 2.4.2 45S组装中间体的鉴定55
• 2.4.3 定量质谱对 45S组装中间体蛋白质组成进行定量分析55-57
• 2.4.4 45S组装中间体电镜数据处理57-58
• 2.4.5 构建各类组装中间体的原子模型58-59
• 2.4.6 构建各组装中间体原子模型的温度图谱（Temperature Map）59-60
• 2.5 实验结果60-89
• 2.5.0 成熟 50S大亚基的提取、纯化60-61
• 2.5.1 成熟 50S大亚基结构解析61-64
• 2.5.2 45S核糖体的纯化、验证64-66
• 2.5.3 不成熟 45S亚基蛋白质组成的定量质谱分析66-70
• 2.5.4 不成熟 45S核糖体颗粒的二维图像分析70-72
• 2.5.5 不成熟 45S组装中间体的冷冻电镜三维结构分析72-78
• 2.5.6 45S组装中间体的功能中心是高度不稳定的78-81
• 2.5.7 45S组装中间体 23S rRNA的结构域IV和V没有完成正确组装81-84
• 2.5.8 H38的重定向是 50S亚基组装后期关键的限速步骤84-86
• 2.5.9 体内 50S大亚基后期组装过程模型86-89
• 2.6 本章小结89-91
• 第3章 大亚基组装因子YlqF与 50S亚基相互作用的研究91-108
• 3.1 引言91
• 3.2 实验仪器91
• 3.3 实验材料与实验方法91-96
• 3.3.1 ylqF△N10菌株中不成熟 45S核糖体的纯化与结构解析91-92
• 3.3.2 枯草芽孢杆菌YlqF蛋白的过量表达与纯化92-95
• 3.3.3 YlqF与 50S或 45S核糖体的结合验证以及二者复合物的获得95-96
• 3.3.4 YlqF与 50S/45S复合物冷冻电镜样品制备、数据收集与数据处理96
• 3.4 实验结果与分析96-106
• 3.4.1 ylqF△N10菌株中不成熟 45S核糖体结构解析96-98
• 3.4.2 YlqF蛋白质的过量表达、纯化98-99
• 3.4.3 YlqF与50S/45S结合验证以及二者复合物的组装99-102
• 3.4.4 YlqF与 45S组装中间体复合物结构102-104
• 3.4.5 YlqF与成熟 50S亚基复合物结构104-105
• 3.4.6 YlqF在 50S亚基组装过程中的功能分析105-106
• 3.5 本章小结106-108
• 第4章 其他工作：MecA-ClpC复合物的冷冻电镜结构研究108-114
• 4.1 引言108-109
• 4.2 实验方法109
• 4.2.1 MecA和ClpC突变体的纯化与六聚体复合物的装配109
• 4.2.2 冷冻电镜样品制备109
• 4.2.4 原子模型的柔性Fitting（Flexible Fitting）109
• 4.3 实验结果与分析109-112
• 4.3.1 四种状态复合物的冷冻电镜结构解析109-110
• 4.3.2 中央孔洞的可塑性和D1 loop的位置110-111
• 4.3.3 MecA的N端结构域控制底物进入ClpC解旋酶111
• 4.3.4 核苷酸水解诱导D1和D2两层环状结构之间的相对旋转111-112
• 4.4 本章小结112-114
• 第5章 讨论与展望114-119
• 5.1 总结114-118
• 5.1.1 研究内容总结114-116
• 5.1.2 相关讨论：核糖体组装的质量控制机制116-117
• 5.1.3 冷冻电镜技术在本研究中的重要作用117-118
• 5.2 展望118-119
• 5.2.1 YlqF作用机制方面118
• 5.2.2 大亚基组装过程研究方面118-119
• 参考文献119-133
• 致谢133-135
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果135

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本文编号：933489