同源Hsp20和异源IL-10基因在蛋白质Sec-分泌体系修饰的长双歧杆菌NCC2705中的表达

发布时间：2017-10-04 10:09

  本文关键词：同源Hsp20和异源IL-10基因在蛋白质Sec-分泌体系修饰的长双歧杆菌NCC2705中的表达

  更多相关文章： 长双歧杆菌 功能蛋白表达 蛋白质投递 Sec-分泌系统 遗传修饰

【摘要】：双歧杆菌自1906年Henry Tissier发现以来,已成为一类重要的益生菌,益生功能的研究也不断深入。根据双歧杆菌的安全性和其经消化道生存、定殖和生物被膜生成的能力,成为一种优良的口服和肠道活菌调节菌。利用双歧杆菌的益生和生物特性,具备作为安全的口服活体功能蛋白肠道投递类的基因工程疫苗载体宿主的潜在特质与基本条件。为了研究双歧杆菌作为内、外源功能蛋白表达和肠道定殖投递载体体系的可行性,本研究选取长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) NCC2705菌株作为基因工程疫苗投递模式载体,从同源基因表达、异源基因分泌表达及对分泌表达体系修饰进而影响所表达和投递目标蛋白的分泌的影响几个方面对其投递载体功能进行探索和评价。 同源基因nHsp的超表达 长双歧杆菌遗传转化和筛选困难体系是限制其研究和应用的瓶颈。本体系首先以同源基因超表达技术构建用以建立长双歧杆菌的转化与筛选体系,以及对目标蛋白的超量表达可能产生的细胞生理等功能的影响,判定转化体系与目标蛋白质的构象及其产生功能进行评价。研究通过构建了具有大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭表达质粒,该质粒的蛋白质表达盒有Pgap启动子和Thup终止子构成,表达质粒命名为pDP401。sHsp基因所编码的蛋白是参与双歧杆菌胁迫应答机制的小热激蛋家族因子。克隆并将sHsp基因插入pDP401表达盒中形成pDP401-sHsp载体,并通过优化的电转化技术转化到长双歧杆菌NCC2705中,得到的重组的长双歧NCC2705转化菌株o sHsp转化菌株在各种非生物胁迫(热胁迫、高温胁迫、酸胁迫、胆盐胁迫等)条件下的细胞生长活力、细胞密度及产酸能力与野生型NCC2705对照菌株相比均有显著性提高,表明JHsp基因的超表达能够使长双歧杆菌NCC2705有效地抵御胁迫。以上结果表明,我们构建了功能性的穿梭型长双歧杆菌蛋白质表达质粒,建立了有效的电转化体系和成功的筛选技术,向难于转化的长双歧杆菌中导入了抗性标记的具有蛋白质表达盒结构的穿梭质粒,其启动子表达盒能有效地启动目标基因蛋白的转录和完成目标蛋白的合成表达,并产生有正确功能的蛋白。 异源基因编码蛋白的表达 利用上述研究构建的双歧杆菌蛋白质表达穿梭质粒骨架,我们构建了人-白介素(IL-10)基因的异源表达载体pDP870-IL10,并成功实现在NCC2705转化株中的表达。表明长双歧杆菌对外源基因密码子使用偏好性的差异具有一定的兼容性,其作为蛋白质表达宿主菌具有一定的密码子偏好性冗余度,能对未进行密码子优化的人-白介素基因适度表达。这表明长双歧杆菌NCC2705可以作为一种外源目标蛋白的表达工程菌菌株。长双歧杆菌NCC22705蛋白质See-分泌体系的异源SecDF表达修饰 SecD/F是许多细菌蛋白质Sec-分泌体系的重要构成组分。但在许多乳酸菌和双歧杆菌属基因组中,缺少secDF基因编码。Streptomyces coelicoler中的具有较强的蛋白质分泌功能,其Sec-体系的secDF蛋白为融蛋白由secDF编码。本研究通克隆了S. coelicoler的secDF基因,构建成长双歧杆菌异源蛋白表达质粒pDP870-secDF,并转化到长双歧杆菌NCC2705中,实现异源SecDF的表达。通过sqRT-PCR的方法检测并验证了secDF基因在长双歧杆菌NCC2705转化株中的表达。本研究也是首次在双歧杆菌中实现通过Sec-分泌系统的异源蛋白组分的表达转化。 长双歧分泌表达系统修饰对异源表达IL-10的分泌与功能实现 为验证Sec分泌系统对异源蛋白表达后蛋白质分泌的影响,本论文对转化后的菌株含有secDF基因及不含secDF基因的人IL-10表达质粒阳性菌株菌体细胞孵育液/培养基总蛋白质进行了蛋白质免疫杂交印迹(Western blot)检测。结果显示,存在分泌系统修饰组分secDF的长双歧杆菌NCC2705与不存在分泌系统的长双歧杆菌NCC2705表达的人IL-10含量存在一定的差异。长双歧分泌的IL-10的生物功能通过IL-10对人HT-29细胞株肿瘤坏死因子TNF-α诱导的炎症反应抑制得到验证,表明长双歧杆菌对外源蛋白表达后的分泌能通过对双歧杆菌分泌体系修饰进行工程化定向塑造。蛋白质Sec-分泌系统的改造,对以益生菌为肠道活体疫苗投递宿主的应用具有一定的前景。
【关键词】：长双歧杆菌 功能蛋白表达 蛋白质投递 Sec-分泌系统 遗传修饰
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• ABSTRACT5-8
• 摘要8-15
• LIST OF FIGURES15-17
• LIST OF TABLES17-18
• Abbrivations18-19
• Chapter Ⅰ: Introduction19-50
• 1.1 Bifidobacteria19-20
• 1.2 Gene expression in Bifidobacteria20-29
• 1.3 Functional assay of probiotic organisms29-34
• 1.4 Protein secretion in lactic acid bacteria/bifidobacteria34-44
• 1.4.1 Sec system37-38
• 1.4.2 Components of sec system38-44
• 1.5 Signal peptides44-46
• 1.6 Vaccine delivery46
• 1.7 IL-10 gene46-48
• 1.8 The aim of this study48-49
• 1.9 The general research technique route49-50
• Chapter Ⅱ: Homologous sHsp expression in bifidobacterium longum NCC270550-75
• 2.1 Introduction50-52
• 2.2 Materials and Methods52-63
• 2.2.1. Bacterial strains,plasmids,and culture conditions52
• 2.2.2 Media preparation52-53
• 2.2.3 Antibiotics53
• 2.2.4 IPTG and X-gal solution53
• 2.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents53-55
• 2.2.6 Reagents for DNA extraction55-57
• 2.2.7 DNA extraction of B.longum NCC270557-58
• 2.2.8 TAE Agarose Gel Electrophoresis analysis58
• 2.2.9 Cloning of hsp20(BL0576)from B.longum strain NCC270558
• 2.2.10 Recycling/Purification of PCR products58
• 2.2.11 TA cloning PCR products of homologous shp 20 gene58-59
• 2.2.12 Transformation of PCR products into E.coli DH5α59
• 2.2.13 Preparation of Plasmid DNA and quantification of DNA59
• 2.2.14 Digestion of DNA59
• 2.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA59-60
• 2.2.16 Ligation reaction60
• 2.2.17 Construction of expression vector and transformation60
• 2.2.18 Assay of stress tolerance of hsp20-overproducing B.longum NCC270560-61
• 2.2.19 Quantitative reverse transcription PCR(qRT-PCR)61-62
• 2.2.20 Statistical Analysis62-63
• 2.3 Results63-71
• 2.3.1 Cloning of homologous hsp 20(sHsp)gene and construction of homologous expression cassette63
• 2.3.2 Overexpression of hsp20(sHsp)in B.longum NCC270563-65
• 2.3.3 Heat-stress tolerance of sHsp-overproducing B.longum NCC270565-67
• 2.3.4 Salt-stress tolerance of sHsp-overproducing B.longum NCC270567-68
• 2.3.5 Multiple stress tolerance of hsp20-overexpressing B.longum NCC270568-71
• 2.4 Discussion71-74
• 2.5 Summary74-75
• Chapter Ⅲ: Heterologous IL-10 transformation in Bifidobacterium longum NCC270575-89
• 3.1 Introduction75-77
• 3.2 Materials and Methods77-82
• 3.2.1 Bacterial strains,plasmids,and culture conditions77
• 3.2.2 Media preparation77-78
• 3.2.3 Antibiotics78
• 3.2.4 IPTG and X-gal78-79
• 3.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents79
• 3.2.6 Reagents for DNA extraction79
• 3.2.7 DNA extraction of B.longum NCC270579
• 3.2.8 Cloning of expression cassette(PGAP-IL10-Thup)from pESH9379
• 3.2.9 TAE agarose Gel Electrophoresis analysis79
• 3.2.10 Recycling/Purification of PCR products79-80
• 3.2.11 TA cloning of IL-10 gene80
• 3.2.12 Transformation of heterologous IL-10 into E.coli DH5α80
• 3.2.13 Plasmid DNA isolation and Quantification of DNA80
• 3.2.14 Digestion of DNA80
• 3.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA80
• 3.2.16 Ligation reaction80
• 3.2.17 Heterologous IL-10 expression vector construction and transformation in B.longum NCC80-81
• 3.2.18 RNA isolation and sqRT-PCR81-82
• 3.3 Results82-87
• 3.3.1 pDP870-IL-10 expression vector82-84
• 3.3.2 Transformation of expression vectors in B.longum NCC270584
• 3.3.3 Semi-quantitative reverse transcription of IL-10 gene84-87
• 3.4 Discussion87-88
• 3.5 Summary88-89
• Chapter Ⅳ: Modification of Sec-system of Bifidobacterium longum NCC270589-109
• 4.1 Introduction89-91
• 4.2. Materials and Methods91-98
• 4.2.1 Bacterial strains,plasmids,and culture conditions91-93
• 4.2.2 Media preparation93
• 4.2.3 Antibiotics93-94
• 4.2.4 IPTG and X-gal94
• 4.2.5 TAE agarose gel electrophoresis reagents94
• 4.2.6 Reagents for DNA extraction94
• 4.2.7 DNA extraction of B.longum NCC270594
• 4.2.8 TAE agarose Gel Electrophoresis analysis94
• 4.2.9 Cloning of heterologous secDF and construction of expression vector94-95
• 4.2.10 Recycling/Purification of PCR products95
• 4.2.11 TA cloning of heterologous secDF95
• 4.2.12 Transformation of heterologous sec DF into E.coli DH5α95
• 4.2.13 Plasmid DNA isolation and Quantification of DNA95
• 4.2.14 Digestion of DNA95-96
• 4.2.15 Gel purification/Recycling of Digest DNA96
• 4.2.16 Ligation reaction96
• 4.2.17 Modification of sec system in B.longum NCC270596
• 4.2.18 RNA isolation and sqRT-PCR96-98
• 4.3 Results98-105
• 4.3.1 pDP870-SecDF expression vector98-100
• 4.3.2 pDP870-SecDF-IL10 expression vector100-101
• 4.3.3 Transformation of expression vectors and modification of sec machinery in Bifidobacterium longum NCC2705101-103
• 4.3.4 RNA isolation and semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction103-105
• 4.4 Discussion105-107
• 4.5 Summary107-109
• Chapter Ⅴ: Protein expression and function assay in sec-System modified Bifidobacterium longum NCC2705109-125
• 5.1 Introduction109-111
• 5.2 Material and methods111-117
• 5.2.1 Strains, reagents and solutions111-112
• 5.2.2 Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis112-113
• 5.2.3 Preparation of bacterial cell fractions113
• 5.2.4 TCA precipitation of supernatant protein113-114
• 5.2.5 Coomassie staining114
• 5.2.6 Western blotting114
• 5.2.7 Binding of transferred protein with specific antibodies114-115
• 5.2.8 Culture condition and epithelial HT-29 cell line application on sec modified Bifidobacterial strains115-117
• 5.3 Results117-122
• 5.3.1 Protein secretion of B. longum NCC2705117-118
• 5.3.2 Western blot analysis for IL-10 secretion in B. longum NCC2705118-120
• 5.3.3 Cellular functional assay of the IL-10 expressed by Sec-modified transformant120-122
• 5.4 Discussion122-124
• 5.5 Summary124-125
• Chapter Ⅵ: Summary, conclusion and suggestion125-132
• 6.1 Summary125-130
• 6.1.1 Overexpression of sHsp(hsp 20 BL05763) in B. longum NCC2705125
• 6.1.2 Heat-stress tolerance of sHsp-overproducing B. longum NCC2705125-126
• 6.1.3 Salt-stress tolerance of sHsp-overproducing B. longum NCC2705126
• 6.1.4 Multiple stress tolerance of Hsp20-overexpressing B. longum NCC2705126-127
• 6.1.5 pDP870-IL-10 expression vector127
• 6.1.6 Transformation of heterologous IL-10 expression vector in B. longum NCC2705127
• 6.1.7 RNA isolation and sqRT-PCR for IL-10127
• 6.1.8 pDP870-secDFexpression vector127-128
• 6.1.9 pDP870-secDF-IL-10 co-expression vector128
• 6.1.10 Transformation of expression vector and modification of sec machinary in B.longum NCC2705128
• 6.1.11 RNA isolation and sqRT-PCR for secDF and IL-10128
• 6.1.12 Protein expression in B.longum NCC2705128-129
• 6.1.13 Western blot129
• 6.1.14 Cellular functional assay of the IL-10 expressed by sec-modified transformant129-130
• 6.2 Conclusion130-131
• 6.3 Suggestion131-132
• Literature cited132-152
• Acknowledgements152-154
• Curriculum Vitae154-156

【共引文献】

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5 曾诚;二苯乙烯苷对炎症性肠病的作用:诱导PPAR-γ和抑制NF-κB炎症通路[D];华中科技大学;2011年

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3 薛峰;干酪乳杆菌ATCC 393在不同环境因子胁迫下的生理应答[D];江南大学;2010年

4 温美丽;酪酸梭菌对溃疡性结肠炎小鼠ITF，NF-κB和TNF-α表达的影响及意义[D];山西医科大学;2011年

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10 付娟;胆固醇氧化酶的异源表达和应用研究[D];山东大学;2011年

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本文编号：970049