Bacillus licheniformis角蛋白酶的高效表达、热稳定性及底物特异性改造

发布时间：2017-10-08 18:24

  本文关键词：Bacillus licheniformis角蛋白酶的高效表达、热稳定性及底物特异性改造

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【摘要】：角蛋白酶是种特殊的可以降解角蛋白的蛋白酶类，其在饲料、织物处理、清洁剂、医药等行业具有广泛的应用价值。本论文筛选到株对羊毛具有明显降解作用的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis BBE11-1），通过对表达宿主、调控元件和产酶条件进行优化提高了角蛋白酶基因ker的表达量。随后对重组角蛋白酶的酶学性质进行了研究，并在此基础上通过分子改造提高了重组角蛋白酶的热稳定性和对α-角蛋白的底物特异性，主要研究结果包括： （1）筛选到株对羊毛具有明显降解作用的地衣芽孢杆菌（B. licheniformis BBE11-1）。将其角蛋白酶基因ker分别在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及毕赤酵母中实现了胞外分泌表达。通过优化诱导剂IPTG和酵母粉浓度，角蛋白酶在大肠杆菌中的胞外酶活最高达到350U·mL-1。通过碳源和金属离子的优化，枯草杆菌重组菌B. subtilisWB600/pMA5-ker的胞外酶活最高达到386U·mL-1。而重组毕赤酵母pPIC9K-ker/P.pastoris GS115在甲醇诱导浓度为10g·L-1时，重组角蛋白酶的酶活最高可达285U·mL-1，重组角蛋白酶为经过糖基化修饰的蛋白。在此基础上，分别对重组菌B.subtilis WB600/pMA5-ker、 B. subtilis WB600/pSTOP1622-ker和P. pastorisGS115/pPIC9K-ker在3L发酵罐上进行发酵产酶研究，结果发现B. subtilisWB600/pSTOP1622-ker可以达到较好的产酶效果，酶活最高可达1840U·mL-1。 （2）对三种重组角蛋白酶进行了纯化与酶学性质研究。重组角蛋白酶的最适反应pH为10，在碱性环境（pH8-11）具有较好的稳定性。KerE（大肠杆菌重组酶），KerB（枯草芽孢杆菌重组酶）和KerP（毕赤酵母重组酶）的最适反应温度分别为50，40和70℃。KerE和KerB的热稳定性较差，而KerP的热稳定性则较好。重组酶为丝氨酸蛋白酶，，对金属离子、螯合剂和抑制剂呈现出相同的反应趋势。同时，重组酶在表面活性剂及H2O2存在的条件下稳定性较好。KerB的米氏常数（Km）为2.42mmol·L-1，最大反应速率（Vmax）为35.84mmol·min-1，催化常数（kcat）和专性常数（kcat/Km）分别为22.61s-1和9.34L·(s·mmol)-1。当采用混合酶体系（1%OWF Savinase和60%OWF角蛋白酶）处理羊毛纤维1h后可以达到较好的防毡缩效果，而单独采用60%OWF角蛋白酶处理羊毛纤维36h后同样可以取得较好的防毡缩效果，同时纤维强度的损失也小于双酶处理方法。 （3）分别通过B-FITTER、PoPMuSiC软件预测以及NAMD分子动力学模拟识别角蛋白酶的不稳定区域，与同源比对分析相结合，分别构建了12株突变体。验证获得四正效应的突变体N122Y、N217S、A193P和N160C。其中突变体N122Y在60℃条件下的t1/2值由9min提高到23min，催化活力（kcat/Km）与野生型相比提高了5.6倍。对四个正效应突变点进行了组合突变，获得的组合突变体展现了较好的协同效应，在60℃条件下的t1/2值较野生型提高了8.6倍。对突变体提高热稳定性的原因分析显示，突变体较野生型主要增加了6对疏水相互作用力，1对cation-pi作用力以及11对氢键作用力，其中N122Y提供了3对疏水相互作用力。 （4）为了提高角蛋白酶对ɑ-角蛋白（羊毛鳞片）的底物特异性，通过定点突变对角蛋白酶底物结合区域S1及S4进行了改造。结果表明，缩小S1和S4底物结合区域会降低角蛋白酶对酪蛋白及ɑ-角蛋白的活力，说明底物结合区域的大小对角蛋白酶对ɑ-角蛋白的特异性影响较大。而以合适的构象增大S4底物结合区域（M134A）虽然降低了角蛋白酶对酪蛋白的活性，却会增加其对ɑ-角蛋白的活力。通过氨基酸分析、XPS表面元素和动力学分析发现，突变体M134A对ɑ-角蛋白的特异性增强很可能是由于其增加了对羊毛鳞片蛋白中的Lys、Cys和Asp的亲和性。对突变体酶的羊毛织物防毡缩效果进行评估，结果证明突变体M134A较野生型角蛋白酶具有更好的羊毛织物防毡缩效果。 （5）对蛋白酶前导肽切割区域进行改造。结果发现在角蛋白酶前导肽切割位点的P1位置引入Ala残基可以促进成熟酶的胞外分泌，而前导肽C端结构的变化会影响成熟酶的胞外分泌。缺失或替换角蛋白酶的N端会大幅度降低酶活力，说明其结构对于角蛋白酶成熟酶的有效分泌是必须的。将角蛋白酶N端AQTVP替换为Thermoactinomyces vulgaris来源的嗜热蛋白酶的N端YTPNDPYFSSRQ可以有效的提高角蛋白酶的热稳定性，在60℃条件下的t1/2值由9min提高到20min。同时，考察了葡萄糖流加速率和诱导菌体密度对重组菌B. subtilis WB600/pSTOP1622-ker在3L发酵罐上发酵产酶的影响，当在分批发酵6h后以6g·(L·h)-1恒速流加葡萄糖15h，诱导菌体密度（OD600）为15时产酶效果最佳，酶活最高可以达到3017U·mL-1，为目前报道的最高值。
【关键词】：角蛋白酶 地衣芽胞杆菌 热稳定性 底物特异性 前导肽
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 目录7-11
• 第一章 绪论11-24
• 1.1 角蛋白及角蛋白酶概述11-19
• 1.1.1 角蛋白简介11
• 1.1.2 角蛋白酶的分类11-12
• 1.1.3 角蛋白酶的理化性质12-15
• 1.1.4 角蛋白酶的结构和底物特异性15-16
• 1.1.5 角蛋白酶的发酵优化16
• 1.1.6 角蛋白酶的克隆表达及分子改造16-18
• 1.1.7 角蛋白酶的主要应用18-19
• 1.2 提高蛋白质热稳定性的策略19-22
• 1.2.1 非理性设计20
• 1.2.2 理性设计20-22
• 1.3 立项依据和研究意义22
• 1.4 本论文的主要研究内容22-24
• 第二章 产角蛋白酶菌株的筛选及角蛋白酶基因的异源表达24-43
• 2.1 前言24
• 2.2 材料与方法24-30
• 2.2.1 质粒、菌株和引物24-25
• 2.2.2 试剂及仪器25-26
• 2.2.3 培养基26-27
• 2.2.4 菌种筛选方法27
• 2.2.5 DNA 操作方法27-28
• 2.2.6 培养条件28-29
• 2.2.7 分析方法29-30
• 2.3 结果与讨论30-41
• 2.3.1 产角蛋白酶菌株的筛选30
• 2.3.2 菌株的遗传学鉴定30-32
• 2.3.3 ker 基因的克隆与分析32-33
• 2.3.4 ker 基因在大肠杆菌中的表达33-34
• 2.3.5 IPTG 和酵母粉浓度对重组角蛋白酶在大肠杆菌中分泌表达的影响34-35
• 2.3.6 ker 基因在枯草芽孢杆菌中的表达35-37
• 2.3.7 碳源和金属离子对重组角蛋白酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响37-38
• 2.3.8 ker 基因在毕赤酵母中的表达38-39
• 2.3.9 重组 B. subtilis WB600 的分批发酵39-40
• 2.3.10 重组 P. pastoris GS115 的高密度发酵40-41
• 2.4 本章小结41-43
• 第三章 重组角蛋白酶的酶学性质研究与应用效果评价43-53
• 3.1 前言43
• 3.2 材料与方法43-45
• 3.2.1 菌株43
• 3.2.2 仪器与试剂43-44
• 3.2.3 培养基及培养条件44
• 3.2.4 重组酶的分离纯化44
• 3.2.5 羊毛防毡缩处理44
• 3.2.6 分析方法44-45
• 3.3 结果与讨论45-51
• 3.3.1 重组角蛋白酶的纯化45-46
• 3.3.2 重组角蛋白酶的最适反应 pH 和 pH 稳定性46-47
• 3.3.3 重组角蛋白酶的最适反应温度和温度稳定性47-48
• 3.3.4 金属离子、螯合剂及不可逆抑制剂对角蛋白酶酶活的影响48
• 3.3.5 表面活性剂、还原剂，漂白剂对角蛋白酶稳定性的影响48-49
• 3.3.6 K:C 值的测定49-50
• 3.3.7 重组角蛋白酶的动力学参数测定50
• 3.3.8 角蛋白酶对羊毛防毡缩应用效果评估50-51
• 3.4 本章小结51-53
• 第四章 计算机辅助分析提高角蛋白酶的热稳定性53-65
• 4.1 前言53
• 4.2 材料与方法53-55
• 4.2.1 菌株53
• 4.2.2 仪器与试剂53
• 4.2.3 DNA 操作53-54
• 4.2.4 培养基及培养条件54
• 4.2.5 晶体结构模型的构建及结构分析54
• 4.2.6 不稳定区域的预测54-55
• 4.2.7 野生型与突变体角蛋白酶的纯化55
• 4.2.8 分析方法55
• 4.3 结果与讨论55-64
• 4.3.1 角蛋白酶三维结构的模拟55-56
• 4.3.2 突变位点的预测56-59
• 4.3.3 突变对角蛋白酶活力的影响59-60
• 4.3.4 突变对角蛋白酶热稳定性的影响60-61
• 4.3.5 突变体的结构模拟及分析61-63
• 4.3.6 突变对角蛋白酶催化活力的影响63-64
• 4.4 本章小结64-65
• 第五章 角蛋白酶底物结合区域的分析与改造65-73
• 5.1 前言65
• 5.2 材料与方法65-67
• 5.2.1 菌株65
• 5.2.2 仪器与试剂65-66
• 5.2.3 DNA 操作66
• 5.2.4 培养基及培养条件66
• 5.2.5 晶体结构模型的构建及结构分析66
• 5.2.6 野生型与突变体角蛋白酶的纯化66
• 5.2.7 分析方法66-67
• 5.3 结果与讨论67-71
• 5.3.1 突变体对角蛋白酶底物特异性的影响67-69
• 5.3.2 突变体对羊毛鳞片降解的氨基酸分析69-70
• 5.3.3 突变体角蛋白酶的动力学分析70
• 5.3.4 突变体角蛋白酶的羊毛织物防毡缩效果评估70-71
• 5.4 本章小结71-73
• 第六章 角蛋白酶前导肽切割区域的分析与改造73-89
• 6.1 前言73-74
• 6.2 材料与方法74-76
• 6.2.1 菌株74
• 6.2.2 仪器与试剂74
• 6.2.3 DNA 操作74-75
• 6.2.4 培养基及培养条件75-76
• 6.2.5 晶体结构模型的构建及结构分析76
• 6.2.6 野生型与突变体角蛋白酶的纯化76
• 6.2.7 分析方法76
• 6.3 结果与讨论76-87
• 6.3.1 前导肽切割位点 Leu(P1)对成熟酶胞外分泌的影响76-78
• 6.3.2 前导肽 C 端对成熟酶胞外分泌的影响78-79
• 6.3.3 成熟酶 N 端对其活力的影响79-83
• 6.3.4 组合突变体的酶学性质检测83
• 6.3.5 恒速流加对 B. subtilis 发酵产酶的影响83-86
• 6.3.6 诱导菌体密度对 B. subtilis 发酵产酶的影响86-87
• 6.4 本章小结87-89
• 主要结论与展望89-92
• 主要结论89-91
• 展望91-92
• 论文创新点92-93
• 致谢93-95
• 参考文献95-106
• 附录 作者在攻读博士学位期间发表的论文106

【共引文献】

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本文编号：995579