TSA预处理对hUC-MSCs神经分化以及干细胞治疗TBI的促进作用

发布时间：2017-12-05 18:17

  本文关键词：TSA预处理对hUC-MSCs神经分化以及干细胞治疗TBI的促进作用

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【摘要】：近年来,神经功能的修复是再生医学领域研究的重点。创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是一种神经功能遭受严重破坏的疾病。由于自身神经功能修复有限,TBI带来的神经功能损害常常会导致残疾甚至死亡。利用干细胞的分化特性来修复受损功能是再生医学研究的重要策略,干细胞的研究经常受到伦理争议和来源的限制,一定程度上阻碍了其在功能修复疾病研究中的应用。因此,我们采用人脐带源性间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,hUC-MSCs)作为研究对象,hUC-MSCs具有分化成神经细胞的潜力、来源广泛以及伦理争议少等优点,在临床上具有很大的应用价值。利用干细胞移植来治疗TBI已经取得一定的成效,但是在病灶区干细胞迁移数量少和分化效率低,极大的阻碍了其在临床上的应用。因此,如何提高干细胞的迁移数量和分化效率成为干细胞治疗TBI的关键。干细胞定向迁移至病灶区主要由SDF-1/CXCR4反应轴来介导,研究发现组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抑制剂,能够使干细胞表面CXCR4的表达水平上调。研究还发现,组蛋白乙酰化可以调控干细胞的增殖和分化,利用HDAC的抑制剂能够促进干细胞的成神经分化。近期研究发现,组蛋白H3亚基赖氨酸残基的乙酰化(H3K9Ac)在维持干细胞多能性和成神经细胞分化中具有积极的作用。曲古抑菌素A(TSA)是HDAC的一种广谱抑制剂,国内外很多文献报道TSA能够抑制Ⅰ型和Ⅱ型HDAC的活性并使H3K9Ac的表达量升高,并且有文献报道TSA能够促进多种干细胞向其它细胞的分化。但是,TSA预处理是否能够促进hUC-MSCs的成神经分化还未知。TSA预处理hUC-MSCs后移植对TBI小鼠的神经修复作用尚未见报道。因此,我们推测TSA处理hUC-MSCs后有可能会促进hUC-MSCs向病灶区的迁移和成神经分化,进而提高hUC-MSCs移植治疗TBI小鼠的神经修复效果。目的通过体外实验研究TSA预处理后对hUC-MSCs增殖、凋亡、迁移以及成神经分化的影响;体内实验通过建立C57BL/6J小鼠的TBI模型,研究TSA预处理的hUC-MSCs移植对TBI小鼠的神经修复效果的影响,为进一步探讨乙酰化在干细胞迁移和成神经分化中的相关分子机制提供基础。方法第一部分、TSA对hUC-MSCs的增殖、分化、迁移以及成神经分化的影响1.分组:将实验分为2组:对照组(MSCs组)和TSA处理组(TSA-MSCs组)。2.流式细胞术和Western Blot检测TSA对hUC-MSCs周期和凋亡的影响。3.Western Blot检测细胞膜上CXCR4的表达量,Transwell检测SDF-1的靶向迁移能力。4.Western Blot检测TSA处理后细胞H3K9Ac和HDAC1的表达量;体外诱导成神经分化后,q RT-PCR检测NSE、DCX的相对表达量。第二部分、TSA处理的hUC-MSCs对TBI小鼠的神经修复作用1.利用立体定位仪将81只C57BL/6J建立TBI模型,随机分为3组:生理盐水组(Veh组)、hUC-MSCs移植组(MSCs组)、TSA处理的hUC-MSCs移植组(TSA+MSCs组),每组27只。2.q RT-PCR检测各组病灶区SDF-1的表达情况,免疫组化检测病灶区人源细胞,初步判断hUC-MSCs的迁移情况。3.统计体重评估小鼠的身体综合状况;神经损伤评分(Neurologic deficit score,NDS)和挂线实验检测小鼠的运动功能、糖水偏好实验检测小鼠的忧郁程度、新事物识别检测小鼠的认知能力;Morris水迷宫检测小鼠的空间学习记忆能力。4.干湿重法检测损伤侧的脑含水量;CV染色评估脑损伤体积;PI检测小鼠病灶区坏死神经元;Western Blot检测凋亡相关的Caspase3-Cleaved、Bcl2的表达情况。5.Ellisa检测炎症相关的IL-4、IL-10、IL-1β、TNF-α,氧化应激相关的SOD、GSH、GSH-Px和MDA的表达量。6.Western Blot检测病灶区乙酰化相关的HDAC1和H3K9Ac的相对表达情况;q RT-PCR检测神经元标记物DCX、MAP2和神经生长因子BDNF、NGF、NT3的相对表达情况;免疫荧光检测脑组织中DCX、Neu N的表达情况。结果第一部分、TSA对hUC-MSCs的增殖、分化、迁移以及成神经分化的影响1.Western Blot和流式结果显示,与MSCs组相比,TSA-MSCs组的凋亡情况无显著差异,细胞被阻滞在G1/S期(P0.05)。2.Western Blot检测,与MSCs组相比,TSA处理后hUC-MSCs膜上的CXCR4表达量上调,差异显著(P0.05);Transwell结果显示,TSA-MSCs组细胞靶向SDF-1的迁移数量明显增多(P0.05)。3.乙酰化水平检测结果显示,TSA-MSCs组较MSCs组乙酰化相关的HDAC1的表达下调,H3K9Ac的表达上调(P0.05);与MSCs组相比,TSA-MSCs组的神经元标记物DCX和NSE表达明显升高,具有统计学差异(P0.05)。第二部分、TSA处理的hUC-MSCs对TBI小鼠的神经修复作用1.各组在病灶区SDF-1的表达情况无显著差异,TSA+MSCs组和MSCs组均能检测到人源细胞的存在,与MSCs组相比,初步推断TSA+MSCs组在病灶区检测到的人源细胞数目更多。2.在体重监测、NDS评分、挂线、糖水偏好、新物体识别和水迷宫等行为学实验中,与Veh组相比,细胞移植治疗组均明显改善小鼠的运动能力、学习认知能力、忧郁程度,TSA+MSCs组的改善效果更佳(P0.05)。3.与Veh组相比,细胞移植治疗组小鼠的损伤侧半球脑含水量明显降低、脑损伤体积减小、病灶区坏死细胞数减少,凋亡相关蛋白Bcl2的表达上升,Caspase3-cleaved的表达下降。TSA+MSCs组的表现更佳(P0.05)。4.与Veh组相比,细胞移植治疗组炎症相关因子IL-4和IL-10表达上升,IL-1β和TNF-α的表达量降低,氧化应激产物MDA的表达量下降,自由基清除物质SOD、GSH、GSH-Px下调,除IL-1β外,TSA+MSCs组上调和下降更明显(P0.05)。5.与Veh组相比,TSA+MSCs组与MSCs组HDAC1的表达量明显下调,H3K9Ac的表达显著升高,TSA+MSCs组差异更明显(P0.05);神经生长因子BNDF、NT3、NGF和神经元标记物DCX、Neu N、MAP2表达量均明显上调,TSA+MSCs组上调更显著(P0.05)。结论1.TSA处理后的hUC-MSCs,乙酰化水平升高,同时,细胞周期受到抑制,凋亡无显著变化,TSA可以促进hUC-MSCs膜上CXCR4的表达,向SDF-1的迁移增加;上调神经元细胞标记物DCX和NSE的表达,促进MSCs向神经元样细胞的分化。2.TSA处理后的MSCs可以迁移到TBI小鼠病灶区中,并提高病灶区的乙酰化水平,改善小鼠的行为能力、减轻脑水肿、减小病灶区的坏死细胞数、减缓炎症,促进MSCs在病灶区的神经再生能力,进而改善MSCs移植对TBI小鼠的神经修复作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R651.15

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本文编号：1255742