基于CHA技术用于单增李斯特菌的新型可视化检测方法建立

发布时间：2017-12-06 22:10

  本文关键词：基于CHA技术用于单增李斯特菌的新型可视化检测方法建立

  更多相关文章： 核酸探针 CHA 信号扩增 试纸条 DNAzyme 可视化 单增李斯特菌

【摘要】：李斯特菌在我们的生活环境中无处不在,绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉、蛋蔬菜等常见食物都已表明是李斯特菌的感染源。李斯特菌可引起严重的疾病感染,许多国家已对食品中的李斯特菌采取相应控制措施,因此其检测方法也是各国关注的焦点之一。检测方法从传统常规的分离培养法到免疫学检测方法,发展到如今的现代分子生物学检测技术。传统常规方法受到耗时长,所需仪器复杂,需要辅助酶等条件的限制。等温扩增CHA(Catalyzed hairpin assembly)是近期发展的现代分子学中新型核酸探针信号放大技术,常温无酶条件下即可实现对核酸靶标的便携、灵敏的检测。本研究利用CHA技术并结合不同的可视化信号输出方式,对单增李斯特菌进行特异检测。本研究的主要内容如下:(1)基于CHA和试纸条建立李斯特菌可视化检测方法基于核酸CHA恒温扩增和试纸条,建立李斯特菌可视化检测的新方法。CHA的两个发夹结构探针H1和H2的5’(或3’)端分别标记Fitc和Biotin,当靶标DNA存在时,试纸条检测线上留下红线标记,并且标记的颜色强度与靶标DNA的浓度在200p M-1n M浓度范围内成线性相关。该方法的检测限可达到36.4 p M,该方法可在常温无酶条件下进行,灵敏好,特异性强。(2)基于CHA和DNAzyme技术对李斯特菌可视化检测基于CHA及DNAzyme建立李斯特菌可视化检测的新方法。CHA一条发夹结构探针茎部包裹固定G-四链体发夹型序列。引发发夹结构与靶标DNA结合时,释放出的引发链启动CHA反应,并打开被包裹住的G-四链体结构,Hemin激活其活性,加入ABTS和H2O2后并发生显色反应,从而实现对靶标DNA的可视化检测。其检测限可以达到60.7 p M。该方法无需任何标记,成本低廉,设计简便,同时将靶标核酸互补片段固定在抓取探针发夹环部分,有效的增加实用性和通用性。(3)基于CHA和DSN酶的双重信号放大建立李斯特菌检测方法基于CHA和DSN酶的双重放大检测方法,DNAzyme作为可视化信号输出方式,检测限达到了434 f M。本方法通过DSN酶辅助的信号扩增结合CHA恒温信号扩增反应,在发夹型结构探针中固定G-四链体结构,在靶标底物存在的条件下,DSN酶可成功作用于DNA-RNA双链,释放CHA引发链,从而引发CHA反应,产生显色变化。本检测平台具有双重放大效果,灵敏度高,特异性强。综上所述,本文成功建立了基于CHA技术用于单增李斯特菌核酸特异性检测的放大平台,实现了特异检测单增李斯特菌,操作简便,成本低廉,抗干扰能力强,检测限可以达到f M,有利于建立低成本快速实样筛选检测,为今后新型检测方法打下良好基础,在临床诊断、食品卫生检验等领域具有广阔的前景。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R155.5

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