人脐带间充质干细胞与牙髓细胞体外共培养的实验研究

发布时间：2017-12-08 08:15

  本文关键词：人脐带间充质干细胞与牙髓细胞体外共培养的实验研究

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【摘要】：研究背景:龋病、根尖周病以及牙周病是口腔常见疾病,常常导致牙髓坏死,影响口腔甚至全身健康。利用细胞生物学、分子生物学等技术手段再生牙髓的组织再生工程研究已成为研究重点。研究目的:本研究通过探索共培养人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)和经BMP2诱导后的人牙髓细胞(human dental pulp cells,DPCs),检测共培养后对细胞生物学性能的影响,并探索两种细胞共培养的最佳比例,为牙髓再生工程研究选择合适的种子细胞以及hUCMSCs进一步应用于牙髓疾病的治疗提供理论依据。材料与方法:(1)人脐带间充质干细胞的分离、培养以及鉴定取健康胎儿脐带,于超净台内剥离外膜及血管,将沃顿胶质组织剪成1mm×1mm×1mm大小组织块,种于培养瓶内,加入1.5ml15%DMEM/F12培养基,置37。C、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,每3天换液一次。待细胞长至80%汇合时传代培养。选取对数生长期细胞进行细胞增殖实验并绘制生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物(CD29、CD44、CD34、CD45),并进行成骨诱导及成脂诱导,观察细胞成骨能力和脂滴形成情况。(2)人牙髓细胞的分离、培养以及鉴定取12-20岁患者因正畸减数拔除的前磨牙,在超净台内清洗干净,敲碎牙齿取出牙髓,剪去根尖部分,将剩余牙髓剪成1mm×1mm×1mm大小组织块,种于培养瓶内,加入1.5ml 15%DMEM/F12培养基,置37。C、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,每3天换液一次。待细胞长至80%汇合时传代培养。选取对数生长期细胞进行细胞增殖试验并绘制生长曲线,检测角蛋白和波形丝蛋白鉴定细胞来源。(3)直接共培养后对细胞生物性能的影响先用BMP2诱导液诱导DPCs14天,通过q PCR检测DSPP、ALP、DMP1 m RNA表达量分析其牙向分化能力。将hUCMSCs与诱导后DPCs的细胞按1:1、1:5、5:1的比例共培养,同时各自单独培养,第7天、14天分别检测DSPP、ALP、DMP1、OCN、Nanog、VEGF、HGF m RNA表达量,比较各组基因表达情况,综合所有基因表达结果,选择1:1组培养21天后进行茜素红染色,酶标仪于562nm处检测沉淀物形成情况;选择1:1组进行细胞增殖实验。结果:(1)分离培养以及鉴定人脐带间充质干细胞组织块培养法第5天开始有细胞从组织块爬出,呈梭形、多角形,12天后达到80%汇合。细胞增殖速度快,呈成纤维细胞状排列。流式细胞仪检测细胞的表面标志物CD29、CD44均呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;成骨及成脂诱导后分别有钙化结节以及脂滴的形成。(2)分离培养以及鉴定人牙髓细胞组织块植入瓶后第3天细胞开始爬出,呈梭形,胞质丰富、核圆、居中,10天后即可传代。传代后细胞增殖速度快。免疫组化染色显示波形丝蛋白阳性表达,角蛋白阴性。(3)BMP2诱导DPCs14天后,其DSPP、ALP、DMP1基因m RNA表达量高于诱导前(P0.05)。两种细胞共培养后,共培养组的DSPP、ALP、DMP1、OCN、VEGF、HGF m RNA表达量均高于hUCMSCs组(P0.05),NANOG m RNA的表达量均低于hUCMSCs组(P0.05)。茜素红染色结果显示:1:1组的OD值高于hUCMSCs组(P0.05),与DPCs组接近。细胞增殖结果显示1:1组增殖速度快。结论:(1)脐带组织块培养法可以获取完整的细胞,经流式细胞仪检测以及成骨、成脂诱导,所获取细胞符合hUCMSCs生物学特征。(2)牙髓组织块培养法所获取细胞经免疫组化染色,结果显示细胞符合DPCs生物学特征。(3)将hUCMSCs与经BMP2诱导后的DPCs以1:1直接共培养,细胞增殖速度快,促进hUCMSCs向成牙本质细胞方向分化以及血管形成相关因子的表达。初步探讨了hUCMSCs具有作为牙髓再生的种子细胞的能力。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.3

【参考文献】

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1 张琴静;陈爱琴;宁松;高超;蒋春艳;崔毓桂;陈娟;覃莲菊;刘嘉茵;;建立不同类型干细胞并比较其分泌细胞因子的水平[J];生殖医学杂志;2016年06期

2 Zhi-yuan Guo;Xun Sun;Xiao-long Xu;Qing Zhao;Jiang Peng;Yu Wang;;Human umbilical cord mesenchymal stem cells promote peripheral nerve repair via paracrine mechanisms[J];Neural Regeneration Research;2015年04期

3 袁长永;王鹏来;张成飞;刘宗响;罗三莲;;根尖牙乳头干细胞和人脐静脉血管内皮细胞联合培养对牙髓组织成血管能力的影响[J];上海口腔医学;2014年05期

4 罗二梅;张家文;胡笑轲;唐明乔;宇丽;;共培养人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)和兔关节软骨细胞诱导hUC-MSCs分化成软骨细胞[J];基础医学与临床;2014年01期

5 熊华翠;陈柯;黄义彬;刘彩奇;;人根尖乳头干细胞生成牙髓牙本质复合体的实验研究[J];南方医科大学学报;2013年10期

6 王璇;刘奕杉;马艳;毕晓娟;郑树涛;刘佳;李伯琦;孙大磊;赵今;;牙周膜干细胞诱导骨髓间充质干细胞的牙向分化[J];细胞与分子免疫学杂志;2013年08期

7 田毅;关方霞;胡祥;杨波;杜英;周长辉;巴云涛;谷晨熙;雷宁静;王晓薇;;人脐带沃顿胶间充质干细胞与脑肿瘤干细胞的共培养[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年10期

8 李德华;单伟;郑晓明;秦书俭;;人脐静脉间充质干细胞体外诱导分化为神经元的可行性[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年08期

9 ;Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J];Chinese Medical Journal;2005年23期

10 叶玲,凌均h，

本文编号：1265677