川芎嗪对香豆酸对拟缺血模型PC12细胞损伤凋亡通路及机制研究

发布时间：2017-12-11 10:24

  本文关键词：川芎嗪对香豆酸对拟缺血模型PC12细胞损伤凋亡通路及机制研究

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【摘要】：中药川芎为临床上常见的中药,它的药效成分川芎嗪,在缺血性脑卒中医治中应用很普遍。为进一步提高药物活性,本课题组在中医理论指导下,利用拼合原理对川芎嗪进行结构修饰得到了一系列新的川芎嗪化合物。其中,化合物川芎嗪对香豆酸(TMP-CA)在前期体外细胞模型筛选中表现出较好的神经保护活性。前期实验证实化合物TMP-CA能够阻断细胞凋亡通路中的线粒体通路,抑制细胞凋亡。(详见张华铮毕业论文)本实验进一步研究化合物TMP-CA对神经生长因子(NGF)诱导分化后,经氯化钴(COCl2)拟缺血损伤大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞凋亡的影响,探索化合物TMP-CA神经保护作用是否涉及死亡受体通路。同时,以临床常用的神经保护剂依达拉奉作为阳性药,对化合物TMP-CA的药效作初步评价。目的:以体外培养的NGF诱导分化的拟缺血损伤的PC12细胞为对象,在前期实验基础上,研究化合物TMP-CA及阳性药依达拉奉对PC12细胞凋亡的影响,化合物TMP-CA神经保护作用是否涉及死亡受体通路,观察化合物TMP-CA及阳性药依达拉奉对Bad、Bcl-xl、NF-κB/P65、Caspase-8等蛋白表达的影响,从细胞和分子水平对化合物TMP-CA对COCl2拟缺血损伤的PC12细胞的作用机理进行探讨。同时,以临床常用的神经保护剂依达拉奉作为阳性药,对化合物TMP-CA的药效作初步评价。方法:1.化合物TMP-CA及阳性药依达拉奉对PC12细胞拟缺血损伤后细胞活性的影响:NGF诱导分化的PC12细胞被分成正常组、模型组、TMP-CA给药组及依达拉奉对照组。将化合物TMP-CA(30 μM)及阳性药依达拉奉(12.5 μM、15 μM、20 μM、25μM)作用于细胞 36h 后,使用 CoCl2(280μmol/L、300μmollL)作用 12h 建立拟缺血损伤模型,MTT法测定给药后PC12细胞活性的变化。2.化合物TMP-CA及阳性药依达拉奉对拟缺血损伤PC12细胞凋亡的影响:采用AO/EB荧光染色及DAPI染色观察给药后PC12细胞凋亡的情况。3.化合物TMP-CA及阳性药依达拉奉对拟缺血损伤的PC12细胞形态的影响及其作用机制:采用HE染色观察细胞形态的改变。免疫细胞化学方法观察PC12 Bad、Bcl-xl蛋白表达变化。4.化合物TMP-CA及阳性药依达拉奉对拟缺血损伤的PC12细胞内蛋白表达的影响:Western Blot 法检测化合物 TMP-CA 对 PC12 细胞 NF-κ B/P65、Caspase-8 蛋白表达的影响。结果:1.MTT法检测结果表明:化合物TMP-CA能够提高分化后拟缺血损伤的PC12细胞活性,EC50值为13.02μM。阳性药依达拉奉能够提高分化后拟缺血损伤的PC12细胞活性,确定阳性药依达拉奉最佳给药浓度为20μM,化合物TMP-CA对PC12细胞拟缺血损伤后细胞活性的影响与阳性药依达拉奉效果接近,依达拉奉EC50值为8.72 μ M。最佳造模浓度为300 μ mol/L。2.化合物TMP-CA(30μM)及阳性药依达拉奉(20uM)作用于分化后拟缺血损伤的PC12细胞后:AO/EB荧光染色:与模型组相比给药组及阳性对照组中橘红色荧光减少,坏死及凋亡的细胞减少。DAPI染色:正常细胞核染为蓝色,COCl2损伤后,细胞数量显著减少,细胞深染,染色质高度聚集、趋于边缘、为团块或新月状。给药组及对照组PC12数量变多,胞核状态好转,多数呈椭圆状。3.形态学结果观察:①HE染色可见,分化后正常组细胞为多角形,神经突处生长良好,模型组中细胞突起变短或消失,出现胞膜破裂及细胞皱缩,化合物TMP-CA组及阳性药依达拉奉对照组中细胞维持正常形态,细胞突起生长正常、密集;②模型组Bcl-xl蛋白阳性表达和正常组相比较弱,部分细胞由于胞膜的破裂,蛋白表达部位较为弥散,化合物TMP-CA给药组和阳性药依达拉奉对照组细胞中Bcl-xl表达有所增强;与正常组相比,模型组中Bad蛋白阳性表达增强,而化合物TMP-CA给药组及阳性药依达拉奉组细胞中Bad蛋白呈现出不同程度减弱。4.化合物TMP-CA(30 μM)及阳性药依达拉奉(20 μM)作用于拟缺血损伤的PC12细胞后:Western blot结果表明化合物TMP-CA及阳性药依达拉奉对NF-κ B/P65的表达影响不明显,差异不具有统计学意义(P0.05)。模型组中Caspase-8的表达增强;与模型组比较化合物TMP-CA使Caspase-8的表达略有升高,但差异不具有统计学意义(P0.05);与模型组比较阳性药依达拉奉使Caspase-8的表达略有降低,但差异不具有统计学意义(P0.05)。结论:化合物TMP-CA在PC12细胞拟缺血损伤模型中有如下表现:①提高细胞活性(EC50=13.02);②抑制PC12细胞凋亡;③提高Bcl-xl蛋白表达,下调Bad蛋白表达;④不影响NF-κB/P65、Caspase-8的表达。化合物TMP-CA不是作用于死亡受体通路以减少细胞因缺血损伤引起的凋亡。化合物TMP-CA在减少细胞凋亡,发挥神经保护方面药效显著,与阳性药依达拉奉药效接近。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：1278111