赖氨酸氧化酶和血管内皮生长因子在缺氧微环境中促进乳腺癌发生上皮间质转化的机制研究

发布时间：2017-12-12 14:10

  本文关键词：赖氨酸氧化酶和血管内皮生长因子在缺氧微环境中促进乳腺癌发生上皮间质转化的机制研究

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【摘要】：研究背景:乳腺癌在全球范围内为女性最常见的恶性肿瘤,死亡率较高。在肿瘤的演进过程中,肿瘤转移是导致乳腺癌患者死亡的最主要原因。缺氧微环境广泛存在于实体肿瘤中,在乳腺癌的发生发展过程中发挥了重要作用,研究表明,25%-40%的侵袭性乳腺癌都发生在组织相对缺氧的区域。在缺氧微环境中,缺氧诱导因子1(Hypoxia-inducible factor HIF-1)被激活,从而调控其下游因子的表达,包括赖氨酸氧化酶(lysyl oxidase LOX)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell groeth factor VEGF),引起一系列的缺氧适应性反应。研究已经证实肿瘤组织内缺氧是影响肿瘤患者生存率的独立因素(独立于临床分期、病理分级、淋巴结转移情况等)。缺氧部位的肿瘤细胞具有更强的侵袭性表型,增加了乳腺癌的转移风险和对放、化疗的耐受,并且诱导癌细胞发生免疫逃逸。大多数恶性肿瘤在演进过程中均伴有上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)过程的发生,EMT是上皮细胞经过特定程序获得细胞间质表型特征的生物学过程。也是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的重要生物学过程,从而使肿瘤细胞获得更强的侵袭和转移的能力,不仅如此,EMT在缺氧微环境中也发挥了重要的作用。在胚胎发育、慢性炎症、组织重建、癌症转移及多种纤维化疾病中发挥了重要作用,其主要特征包括细胞粘附分子(如E-钙黏蛋白)表达减少、角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白(vimentin)为主的细胞骨架及形态上具有间质细胞的特征,波形蛋白、纤维连接蛋白、N-钙黏蛋白表达增多,多种蛋白酶表达升高,如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)。在EMT过程中,上皮细胞失去了细胞极性,失去与基底膜连接等的上皮表型,获得了较高的迁移和侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质能力等的间质表型。EMT是一个由多种途径共同调控的过程,参与EMT过程的细胞内信号转导途径包括TGF-β/Smad途径、Wnt/β-catenin途径、受体酪氨酸激酶Ras-MAPK途径、Src激酶、Rho家族激酶、PI3K/AKT途径等。缺氧可影响EMT的相关基因表达,进一步诱导干细胞表型。EMT过程中,细胞和细胞之间的连接成分减少,细胞骨架重塑获得纺锤样的细胞形态,动态的肌动蛋白微丝网络移动性增加,为肿瘤转移提供可能。在肿瘤转移的过程中,上皮细胞离开原发肿瘤部位,黏附并侵袭基质部位,进入血液循环并且扩散到达远处的组织器官,在远处的组织内增殖形成继发肿瘤。EMT被认为是肿瘤发生转移的这个复杂过程中的第一步。转移是肿瘤致死的主要原因之一,因为肿瘤一旦发生转移,病灶将扩散至全身,越来越多的研究显示,缺氧微环境可以促使肿瘤细胞的转移。50%-60%的实体肿瘤中存在低氧和(或)缺氧区域,低氧环境可以诱导细胞内基因表达重新编程,并最终导致细胞侵袭行为的发生。HIF-1通过上调EMT相关转录因子或抑制因子,激活EMT相关的信号转导通路,调控EMT相关的炎症细胞因子,同时也调控其他的信号转导途径。比如,HIF-1通过转录调控E-cadherin,SNAIL、ZEB1、TWIST、TCF3(transcription factor 3)几种因子诱导EMT过程。本研究以人乳腺癌为研究对象,探讨缺氧微环境与上皮间质转化之间的相互作用,从而为药物研发和临床治疗提供理论依据。方法:实验分为两组:空白对照组(0μmol/L),Co Cl2浓度梯度处理组(50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L,400μmol/L)。(1)划痕实验检测MCF-7和MDA-MB-231细胞迁移能力的变化:各处理组的细胞无血清培养48h,分别于0h,24h以及48h时取样拍照,测量细胞迁移距离。采用Transwell实验检测各组细胞侵袭能力的变化:各处理组细胞分别培养24h以及48h后取样拍照,并计数其穿膜细胞数量。(2)Western blot技术检测MCF-7和MDA-MB-231细胞内蛋白水平的变化。检测指标包括:缺氧诱导因子HIF,金属基质蛋白9—MMP-9,上皮标记物—E-cadherin,间质标记物—Vimentin,PI3K-AKT通路关键分子—PI3K,AKT。(3)ELISA技术检测MCF-7和MDA-MB-231细胞分泌物中分泌型蛋白的表达。检测指标包括:血管内皮生长因子—VEGF,赖氨酸氧化酶—LOX.(4)免疫共沉淀实验检测MCF-7和MDA-MB-231细胞在缺氧环境中表达的VEGF和LOX的相互作用。结果:(1)划痕及侵袭实验结果显示:缺氧微环境赋予乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞更强的迁移、侵袭能力。(2)通过western blot技术对EMT标记物的监测发现:缺氧环境中,与对照组相比,上皮标记物—E-cadherin低表达。间质标记物—Vimentin高表达,与侵袭转移相关的金属基质蛋白酶9—MMP-9高表达,同时对诱导EMT的受体酪氨酸激酶(RTKs/RPTK)的PI3K-AKT通路中重要靶点PI3K和AKT进行检测,发现二者的表达同时上调,与对照组差异显著。暗示缺氧诱导的上皮间质转化是通过激活该通路实现的。(3)通过western blot和ELISA技术发现,在缺氧环境中,血管内皮生长因子和赖氨酸氧化酶同时高表达,基于缺氧微环境和上皮间质转化在促进肿瘤转移当中的重要作用,二者分别作为缺氧诱导因子HIF下游的重要靶点和诱导EMT的受体酪氨酸激酶(RTKs/RPTK)家族中的关键分子,二者的表达量增加可能具有相关性。(4)免疫共沉淀技术进一步验证血管内皮生长因子和赖氨酸氧化酶在诱导乳腺癌细胞发生上皮间质转化过程的缺氧微环境中发挥了协同作用。使用二者的抑制剂有望在临床上为抑制肿瘤的转移提供新思路。结论:缺氧微环境可以诱导乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231发生上皮间质转化,使其具有更强的侵袭、迁移能力。该效应是通过激活PI3K-AKT通路实现的。在缺氧环境下,血管内皮生长因子和赖氨酸氧化酶同时高表达,且二者之间具有相互作用,二者在缺氧微环境中可能协同作用促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】

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1 Zhao-ji LIU;Gregg L.SEMENZA;Hua-feng ZHANG;;低氧诱导因子与乳腺癌转移(英文)[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年01期

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本文编号：1282779