非酒精性脂肪肝病的血清miRNA差异表达谱的初步研究

发布时间：2017-12-15 22:24

  本文关键词：非酒精性脂肪肝病的血清miRNA差异表达谱的初步研究

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【摘要】：第一部分:NAFLD血清miRNA表达谱的筛选目的:本研究拟通过采用高通量测序技术对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)患者和正常人血清(CTL)miRNA的差异表达谱进行分析,以期筛选出NAFLD血清特异性miRNA。方法:(1)依据标准的血清采集操作,收集23例临床确诊为NAFLD患者外周血血清和23例体检健康的正常人的外周血血清标本,控制两组样本的年龄、性别构成比基本匹配,所有患者和志愿者均知情同意并签署知情同意书;(2)从中选取性别、年龄、种族、吸烟史和饮酒史相近的3例NAFLD和3例CTL血清标本作为筛选对象,其余标本用于后续验证实验。(3)使用Trizol法提取两组血清标本的总RNA,并且用Nanodrop2000分光光度仪测定RNA的纯度和浓度,进行RNA质检。(4)文库构建,采用Illumina高通量测序法对两组血清标本总RNA测序(5)通过比对miRBase数据库中miRNA前体和成熟序列,鉴别筛选出NAFLD的差异表达miRNA。结果:(1)Illumina高通量测序以及miRBase数据比对后,在NAFLD组和CTL组共发现129条有差异显著性的miRNA(P0.05),其中表达上调的有103条,表达下调的有26条。已知的有125条,新发现的4条miRNA是:hsa-miR-1357-p3,hsa-miR-1237-p5,hsa-miR-1246-3-p5和hsa-miR-8564-p3。(2)进一步依据表达差异倍数"g2,p0.05的标准,从这125条已知序列的miRNA筛选出4条差异表达的miRNA:hsa-miR-122-5p,hsa-miR-1290,hsa-miR-192-5p和hsa-miR-130a。其中表达差异最为明显的是hsa-mi R-122-5p,上升倍数7.26,其次是hsa-miR-1290和hsa-miR-192-5p,倍数在4.21和3.01。hsa-miR-130a是唯一的下调miRNA,差异倍数2.54。结论:nafld与ctl的血清中存在显著性差异的mirna表达谱,这些mirna可能与nafld的发生发展有着密切关系。第二部分:mirna差异表达谱的验证目的:拟通过实时荧光定量pcr的方法对mirna表达谱进行实验验证,以评估初筛的mirna表达谱的可靠性。方法:(1)用rna提取试剂盒提取已收集的20例nafld组和20例ctl组的血清中rna,采用nanodrop2000分光光度仪测定rna的纯度和浓度(2)进行mirna逆转录反应制备cdna,最后进行qrt-pcr来验证这4个mirna(hsa-mir-122-5p,hsa-mir-1290,hsa-mir-192-5p,hsa-mir-130a)表达水平。结果:与ctl组相比,nafld组hsa-mir-122-5p升高8.25倍,hsa-mir-1290升高3.14倍,hsa-mir-192-5p升高3.58倍,hsa-mir-130a下降2.13倍。结论:差异表达的hsa-mir-122-5p,hsa-mir-1290,hsa-mir-192-5p,hsa-mir-130a这4个mirna进行qrt-pcr后其表达水平与illumina高通量测序结果基本相符。表明nafld患者外周血中存在特异性表达的mirna,以上4个mirna很可能与nafld的发生发展有着密切关系。第三部分:mirna差异表达谱的靶基因预测与分析目的:通过对mirna表达谱的那基因预测及其相关功能分析分析,初步探究血清mirnas表达谱对nafld的影响机制。方法:对已经验证过的4个差异表达mirna(hsa-mir-122-5p,hsa-mir-1290,hsa-mir-192-5p,hsa-mir-130a)进行靶基因预测(软件targetscan,pictar,miranda),go注释、bingo富集和kegg信号通路分析。结果:go注释的靶基因功能显示主要集中在分子功能、细胞成分和生物过程上;kegg通路分析靶基因作用于癌症中的通路(pathwaysincancer),mapk通路(mapksignalingpathway),调节肌动蛋白细胞骨架中的通路(regulationofactincytoskeleton),焦点粘连(focaladhesion),胰岛素信号通路(insulinsignalingpathway),wnt信号通路(wntsignalingpathway)等等。结论:初步预测经验证的筛选差异表达miRNA所作用的靶基因,分析所得这些miRNA可能对NAFLD的分子功能、细胞成分和生物过程产生一定的作用,其分子机制可能通过胰岛素信号通路,MAPK信号通路,Wnt信号通路等分子信号通路来调控。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575

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本文编号：1293657