还原响应型糖脂嫁接物胶束序贯递释siRNA与阿霉素的克服肿瘤耐药研究

发布时间：2017-12-16 15:02

  本文关键词：还原响应型糖脂嫁接物胶束序贯递释siRNA与阿霉素的克服肿瘤耐药研究

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【摘要】：肿瘤多药耐药(Multidrug resistance, MDR)是导致化疗失败的主要原因之一,外排蛋白P-糖蛋白(P-gp)的高表达是肿瘤耐药细胞的重要特征,耐药细胞的P-gp可将化疗药物如阿霉素等外排,导致化疗失败。研究表明,siRNA可沉默MDR1基因,实现P-gp表达的下调,从而提高耐药细胞对阿霉素的敏感性。本研究采用还原响应型糖脂纳米载体(CSO-ss-SA)序贯递释siRNA及DOX, siRNA下调P-gp浓度近最低点,实施序贯给药,可得到最优的给药系统药物疗效。采用两步酰胺反应法,合成还原响应型糖脂嫁接物CSO-ss-SA。核磁共振氢谱法确证嫁接物结构。三硝基苯磺酸法测定氨基取代度8.12±1.08%。CSO-ss-SA在水中自聚集,可形成类球形且分布均匀胶束。临界胶束浓度38.9μg/mL。胶束数均粒径及表面电位分别为79.9±3.7nm及23.3±1.7mV。CSO-ss-SA胶束通过静电作用密接siRNA,形成CSO-ss-SA/siRNA复合物。凝胶阻滞实验及酶保护实验显示,复合物N/P=150时,CSO-ss-SA可有效密接、保护siRNA。复合物数均粒径及表面电位分别为39.6±3.9nm及10.5±0.9mV。体外释放研究表明,复合物在10mM和0mM谷胱甘肽(Glutathione, GSH)介质中,12h累计释放量分别为71.6%,28.9%,在10mM谷胱甘肽介质中的释放速率明显快于在无谷胱甘肽介质中。以碱基阿霉素为模型药物,透析法制备嫁接物载药纳米粒(CSO-ss-SA/DOX),载药纳米粒数均粒径65.7±2.2nm,表面电位13.9±0.8mV。当阿霉素投药量为10%时,载药纳米粒的包封率和载药量分别为67.4±3.0%和6.39±0.26%。体外释放研究表明,在GSH浓度为10mM介质中,载药纳米粒具有快速释药行为,释放速率明显快于其在OmMGSH介质中。以MCF-7/ADR为模型细胞。细胞摄取结果显示,CSO-ss-SA/siRNA的内化过程呈时间依赖性,且摄取速率较快,能有效从内溶酶体中逃逸。实时荧光定量PCR (Real Time-PCR)测定MCF-7/ADR细胞内MDR1基因表达,结果显示,MCF-7/ADR细胞与CSO-ss-SA/siRNA复合物共孵育48h,细胞内MDR1基因表达下调至40.8%,优于阳性对照的51.2%。CSO-ss-SA/siRNA与MCF-7/ADR细胞共孵育1～7d,P-gp表达量先逐渐下降,后逐渐恢复至正常水平,在共孵育3d时,P-gp表达量最低。共孵育1～3d,P-gp表达量逐渐下降,表明siRNA诱导的MDR1基因表达下降,有一个时间依赖过程。共孵育4～7d,P-gp表达量逐渐升高,表明siRNA作用后MDR1基因功能恢复。CSO-ss-SA/siRNA与MCF-7/ADR细胞共孵育不同的时间,再继续与CSO-ss-SA/DOX共孵育4h序贯给药,结果显示,当CSO-ss-SA/siRNA与MCF-7/ADR细胞共孵育3d,测得的P-gp浓度最低,MCF-7/ADR细胞对CSO-ss-SA/DOX外排最弱。选择siRNA下调P-gp近最低点给药,可得到最佳的药物疗效。CSO-ss-SA/siRNA与CSO-ss-SA/DOX序贯给药,较CSO-ss-SA/DOX直接给药药效提高了2.3倍。胞内ATP浓度变化结果表明,CSO-ss-SA/DOX经内吞途径摄取,消耗了肿瘤细胞内的ATP,抑制了P-gp的外排活性。纳米给药系统具有降低P-gp浓度及活性,减少DOX外排的作用,可实现克服肿瘤耐药的目的。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96;R943

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本文编号：1296433