肺癌胸水中游离核酸及沉淀细胞的基因突变检测

发布时间：2017-12-16 21:00

  本文关键词：肺癌胸水中游离核酸及沉淀细胞的基因突变检测

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【摘要】：实验目的:体细胞突变是癌症的重要特征之一。癌症患者的基因突变检测越来越多地用于诊断、预后及治疗。由于肿瘤具有侵袭性,一些肿瘤不能通过手术的方式来获得标本;而且肿瘤具有异质性,单一局部的组织活检获取的肿瘤基因突变不能全面反映肿瘤的真实状况。近年来,越来越多的报道发现癌症患者体液中含有循环肿瘤细胞及肿瘤游离DNA(cell free DNA),体液中肿瘤游离DNA能够更加全面地反映全身肿瘤的变异情况。相比组织活检,检测体液中cf DNA突变能够实现无创地动态检测肿瘤的进展。因此,以癌症患者体液为材料的“液态活检”成为肿瘤基因突变检测领域的热点,并逐步应用于临床无创检测中。胸腔积液是重要的体液,是肺癌的重要特征,尤其是晚期的肺癌,成为肺癌基因突变研究的重要材料。目前,对于恶性胸腔积液中的cf DNA及其沉淀细胞的肿瘤相关基因的检测主要集中于一个基因的某几个位点上。还没有一个高效并全面覆盖多个基因的建库测序方法来检测恶性胸腔积液中的cf DNA及其沉淀细胞的肿瘤相关基因突变。本课题目的在于建立并优化覆盖50个癌症相关热点基因的外显子区域的多重PCR反应体系和相应的扩增子文库,借助高通量测序技术来检测恶性胸腔积液中目标基因突变。我们对12例肺癌患者的恶性胸腔积液中的cf DNA及其沉淀细胞的靶基因突变情况进行了深入研究,为肺癌的临床诊疗提供理论基础。实验方法:(1)通过在线引物设计工具:Design Studio设计覆盖50个癌症热点基因外显子区域的多重PCR引物;(2)验证并优化靶基因区域的多重PCR反应体系;(3)提取肺癌患者胸水及其沉淀细胞中的游离核酸和基因组DNA并进行定量;(4)多重PCR扩增靶向基因的全部外显子区域;(5)扩增子的末端修复;(6)扩增子文库的构建;(7)文库的质控及Hi Seq Xten平台测序;(8)测序数据质量分析及深度挖掘。实验结果:(1)建立并优化了覆盖50个癌症热点基因外显子区域的多重PCR反应体系。(2)建立了一种新的扩增子文库构建方法。(3)对肺癌患者胸水中的游离核酸以及沉淀细胞的50个癌症热点基因外显子区域的测序数据进行了深度挖掘,实现了对目标基因高灵敏、高通量、无创检测。实验结论:(1)成功建立覆盖50个癌症相关热点基因外显子区域的多重PCR反应体系,这套引物具有覆盖率高,每个PCR反应体系中的引物之间互相干扰性低等优点。(2)建立一种新的用于癌症检测的循环肿瘤DNA靶向基因高通量检测的文库构建方法和数据分析方法,极大地降低了建库成本,加快了分析速度。(3)实现了以肺癌患者胸水为生物样本、低浓度游离核酸为模板的高通量、高灵敏、无创基因检测。本实验方法将为肿瘤患者提供肿瘤基因突变的图谱,为癌症个体化医疗提供较为有利的技术支持,非常适用于临床癌症患者基因突变的筛查。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】

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本文编号：1297426