荭草素对于氧化应激状态下人支气管上皮细胞的作用及机制研究

发布时间：2017-12-17 19:02

  本文关键词：荭草素对于氧化应激状态下人支气管上皮细胞的作用及机制研究

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【摘要】：背景和目的:氧化应激是指机体在各种不利因素刺激下导致体内活性氧的蓄积,氧化与抗氧化失衡的一种状态,也是宿主对抗外界病原菌的先天性免疫反应重要的防御系统。但过度的氧化应激可能导致系统性的炎症反应和组织损伤[1-4]。相关研究表明,氧化应激与肺部疾病(如COPD、哮喘等)有明确的关系[1、7、17、18]:(1)氧化剂可使中性粒细胞的变形能力减弱,促使其在微循环中聚集、活化,活化的中性粒细胞释放ROS,导致组织损伤;(2)氧化应激可以通过激活胞内信号通路(如:核因子-KB等)调节炎症介质的释放,活化中性粒细胞,进一步放大炎症损伤作用[5];(3)通过激活Rho蛋白,氧化应激可以引起巨噬细胞的重构,损伤巨噬细胞的功能,从而导致巨噬细胞不能正常清除病原体、异物及凋亡细胞等[6-7];(4)氧化应激可以导致组蛋白去乙酰化酶2活性降低,促使慢阻肺患者对糖皮质激素敏感性下降[8-9];(5)ROS产生增加可以诱导中性粒细胞释放蛋白酶,破坏肺组织弹性纤维,促使蛋白酶与抗蛋白酶失衡,导致肺气肿的发生。荭草素是传统中药竹叶的有效成分,属于黄酮类化合物[10]。荭草素作用广泛,具有显著的抗氧化,抗凋亡,镇痛,抗脂质形成和抗炎[11-16]等作用。其主要成分已投入临床使用的有荭叶通心软胶囊和荭草复方冻干粉制剂。氧化应激状态下荭草素对人支气管上皮细胞的研究尚不多见,本研究通过体外细胞学实验,应用过氧化氢刺激人支气管上皮细胞,给予不同浓度的荭草素干预,检测其对细胞存活率、凋亡率、形态学及相关蛋白表达情况,探讨氧化损伤时荭草素对人支气管上皮细胞的作用及机制。实验方法:1.人支气管上皮细胞(16HBE细胞)的培养:RPMI-1640培养基+10%胎牛血清,37℃、5%CO_2细胞培养箱中培养,2-3天传代一次;2.过氧化氢对16HBE细胞存活率的影响:用不同浓度(20、100、200uM)的H_2O_2攻击16HBE细胞2h,MTT检测细胞的存活率;3.不同浓度的荭草素(Orientin)干预后细胞存活率的变化:实验分为以下五组,空白对照组(细胞加培养基)、H_2O_2(200uM)、DMSO40uM、Orientin 5uM、Orientin 10uM、Orientin 40uM、H_2O_2(200uM)+Orientin(5uM)、H_2O_2(200uM)+Orientin(10uM)、H_2O_2(200uM)+Orientin(40uM),干预的总时间均为 2h,MTT检测细胞存活率;4.荧光显微镜观察凋亡细胞形态变化:Hoechst33342对16HBE细胞凋亡染色观察细胞形态;5.Annexin-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率;6.Western Blot方法检测各组细胞Cleaved-caspase3/procaspase3凋亡蛋白的表达情况;7.酶标仪检测细胞内SOD(U/mg)的活力;8.Orientin干预后对P-AKT/AKT通路的影响:提取细胞蛋白,Western Blot方法检测各组细胞P-AKT/AKT蛋白的表达水平。技术路线图:结果:1.16HBE细胞在不同浓度H_2O_2刺激下细胞的存活率:予以不同浓度(20、100、200uM)H_2O_2刺激16HBE细胞2h,以MTT法检测细胞存活率。与Con组(97.88±1.87%)相比,H_2O_2随着浓度的增加细胞存活率逐渐降低,20uM H_2O_2刺激16HBE细胞存活率为95.75±3.90%,无明显的统计学差异;100uM的H_2O_2浓度刺激时,细胞的存活率为75.86±1.01%,H_2O_2浓度达到200uM时,存活率降至57.76±2.10%,差别具有统计学意义(P＜0.05);因此,选择200uM H_2O_2作用16HBE细胞2h为诱导氧化应激的最佳浓度;2.Orientin可以增加氧化应激下16HBE细胞的存活率:实验分为以下几组:空白对照组、H_2O_2(200uM)、DMSO40uM、Orientin5uM、Orientin 10uM、Orientin 40uM、H_2O_2+Orientin(5uM)、H_2O_2+Orientin(10uM)、H_2O_2+Orientin(40uM),MTT法检测细胞存活率。DMSO40uM及Orientin(5uM、10uM、40uM)组和空白对照组相比均无统计学差异(图2)。H_2O_2组的细胞存活率与空白对照组相比,明显降低,差别具有统计学意义(P0.05)。H_2O_2+Orientin5uM时与H_2O_2组相比,细胞存活率有所增加,但差别无统计学意义;H_2O_2+OrientinK)uM时细胞存活率明显增加,差别具有统计学意义(P0.05);H_2O_2+Orientin40uM时和H_2O_2相比较细胞存活率增加,差别无统计学意义(P0.05)(图3、表2);3.Hoechst33342染色观察凋亡细胞形态学:荧光显微镜下观察空白对照组16HBE细胞活力良好,染料能少许进入正常细胞,细胞核颜色为低蓝色,核染色均匀;H_2O_2组凋亡细胞较多,膜通透性增加,核呈亮蓝色,有些核破裂、皱缩、染色不均匀;Orientin 10uM+H_2O_2组凋亡细胞减少,细胞核低蓝色多,亮蓝色少,细胞核大部分染色较均匀;Orientin 40uM+H_2O_2组凋亡细胞较H_2O_2组有所减少,亮蓝色,低蓝色多(图4);4.Annexin-FITC/PI流式检测细胞凋亡率:实验分为以下几组Con、H_2O_2、H_2O_2+Ori10uM、H_2O_2+Ori40uM。与Con组凋亡率(0.21±0.05%)相比,H_2O_2组凋亡率为(66.74±7.53%),早凋加晚凋的细胞数明显增多,差别具有统计学意义(P0.05)。H_2O_2+ORI10uM组凋亡率(49.02±6.20%)与H_2O_2组相比,早凋加晚凋的细胞数量明显减少,差别具有统计学差异(P0.05)。H_2O_2+Ori40uM组凋亡率(51.21±6.98%)与H_2O_2组相比,早凋加晚凋的细胞数量减少,但差别无明显的统计学差异(P0.05);5.Orientin可以拮抗氧化应激状态下Caspase3凋亡蛋白的表达:Western blot结果显示(图6),和空白对照组相比,氧化应激组的16HBE细胞Cleaved-caspase3表达水平增加,差别具有统计学意义(P0.05);与H_2O_2组相比,H_2O_2+Orientin1OuM干预后,Cleaved-caspase3凋亡蛋白表达水平降低,总的Caspase3水平无明显变化,差别具有统计学意义(P0.05)。H_2O_2+Orientin40uM组较H_2O_2组凋亡蛋白的表达有所降低,具有统计学差异(P0.05);6.酶标仪检测细胞内超氧化物歧化酶SOD活力:横坐标为实验分组:CON、H_2O_2、H_2O_2+Ori10uM,H_2O_2+Ori40uM,纵坐标反应SOD(U/mg)的活力。由图7、表5可见和CON组(68.76±2.99U/mg)相比,H_2O_2组(34.71±2.55U/mg)SOD的活力明显下降,差别具有统计学意义(P0.05);Orientin(10uM)+H_2O_2组SOD的活力(45.09±2.19U/mg)较H_2O_2组有所增加,差别具有统计学意义(P0.05);Orientin(40uM)+H_2O_2组SOD的活力(41.05±0.75 U/mg)较H_2O_2组有所增加,差别具有统计学意义(P0.05)(图7,表5);7.P-AKT信号通路参与了Orientin对氧化应激状态下支气管上皮细胞的保护作用:Western blot法检测16HBE细胞的的P-AKT/AKT蛋白表达。如图图、表6所示:和CON组相比,H_2O_2组P-AKT/AKT的蛋白表达水平明显降低,H_2O_2+Orientin(10uM)组与氧化应激组相比,P-AKT/AKT蛋白的表达水平明显增加,差别具有统计学意义(P0.05)。H_2O_2+Orientin(40uM)组较H_2O_2组P-AKT/AKT表达有所增加,但差别无统计学意义(P0.05)。结论:1、过氧化氢刺激可导致体外培养16HBE细胞存活率降低;2、一定浓度的荭草素使得氧化应激状态下16HBE细胞的凋亡率降低,凋亡相关蛋白下降,说明荭草素对氧化损伤的保护作用是通过抑制凋亡而产生;3、荭草素抑制凋亡是通过增加T-SOD的活力来对16HBE细胞起保护作用;4、荭草素抗氧化的作用可能与P-AKT/AKT信号通路有关;5、荭草素在浓度5uM和10uM时抗氧化能力增强,当浓度达到40uM时,其抗氧化作用减弱。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】

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本文编号：1301198