运动锻炼对博来霉素诱导的肺纤维化及肥胖相关肺损伤的保护作用及机制
本文关键词：运动锻炼对博来霉素诱导的肺纤维化及肥胖相关肺损伤的保护作用及机制 出处：《上海体育学院》2017年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：研究目的肺组织是机体唯一大面积与外界空气接触的内脏器官,极易受到多种损害。运动锻炼作为一种非药物干预方式,对治疗多种慢性疾病以及肥胖相关的代谢综合症均有良好效果。作为一种新型气体信号分子,硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)具有重要的生理调节功能,H_2S代谢紊乱与多种疾病的发生密切相关。肺纤维化是多种肺损伤共有的病理改变并影响疾病的发展与转归。本文第一部分拟通过建立博来霉素(Bleomycin,BLM)诱导的肺纤维化小鼠模型,探讨运动锻炼能否通过提高机体H_2S的水平而改善BLM诱导的肺纤维化。糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)是临床上应用最为广泛的激素类药物,具有抗炎、抗休克等多种生物学效应。GCs主要在肾上腺合成,但有研究发现在肾上腺以外的多种器官均有GCs合成酶与代谢酶的表达并对局部器官中GCs的含量和活性产生影响。本课题组前期研究脓毒症肾上腺皮质耗竭时发现H_2S可促进肾上腺中GCs的合成,那么H_2S是否同样对肺组织中GCs的含量和活性产生影响?综合考虑炎症与纤维化的关系及GCs的抗炎作用,我们很想知道运动锻炼能否通过提高H_2S水平调节局部GCs的合成和代谢进而改善肺组织炎症并影响肺纤维化状态。由于肥胖的典型病理改变之一即为全身慢性炎症状态,因此,本论文第二部分通过建立肥胖小鼠的运动模型,首先探讨了运动锻炼能否通过调节局部GCs的合成或代谢而改善肥胖相关的肺组织炎症。运动锻炼通过H_2S调节局部GCs进而影响肺纤维化的工作我们将在后续研究中陆续开展。研究方法第一部分:首先验证外源性补充H_2S能否改善BLM诱导的小鼠肺纤维化,选择ICR小鼠40只,随机分为4组:对照组(Control,n=10)、博来霉素组(BLM,n=10)、硫化氢组(H_2S,n=10)、博来霉素+硫化氢组(BLM+H_2S,n=10)。然后探讨运动锻炼对肺纤维化的影响,选择ICR小鼠随机分为4组:对照组(Control,n=10)、博来霉素组(BLM,n=10)、运动锻炼组(Ex,n=10)、博来霉素+运动锻炼组(BLM+Ex,n=10)。以5天/周、45min/天、12m/min的运动方案跑台锻炼4周后,进行肺纤维化模型制作,即对BLM组和BLM+Ex组行进行气管滴注博来霉素,Control组和Ex组滴注生理盐水。待小鼠清醒后继续2周的跑台锻炼,6周后收取肺组织样本。采用HE(Hematoxylin and eosin)和Masson染色法检测肺组织的病理学改变和胶原沉淀情况;采用ELISA法检测羟脯氨酸(hydroxyproline)、Ⅰ型胶原(Collagen I)及TGF-β的含量;采用Western blot方法检测上皮细胞标记物E-cadherin和纤维化标记蛋白α-SMA的表达、转录激活因子(P-Smad2、P-Smad3、Smade4)以及硫化氢合成酶CBS和CSE的蛋白表达。第二部分:选择SPF级C57BL/6野生型小鼠(WT)和ob/ob肥胖小鼠(ob)作为研究区对象,根据随机原则小鼠被分为4组:C57BL/6静置组(Sed-WT组,n=10)、C57BL/6运动组(Ex-WT 组,n=10)、ob/ob 静置组(Sed-ob 组,n=10)、ob/ob 运动组(Ex-ob组,n=10)。采用6天/周、1h/天、12m/min的运动方案进行跑台锻炼6周,运动干预结束后收取肺组织和血浆样本。采用ELISA法检测肺组织炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、MCP-1的水平以及MPO的活性和皮质酮的含量;采用免疫组织化学法标记CD68检测ob小鼠肺组织巨噬细胞浸润程度以及验证GCs关键合成酶 StAR、CYP11A1、CYP21、3β-HSD、CYP11B1 与代谢酶 11β-HSD1、11β-HSD2在小鼠肺组织中是否表达;采用免疫荧光标记、RT-PCR和Western blot方法,定量分析运动锻炼对糖皮质代谢关键酶11β-HSDi和11β-HSD2的影响。RU486是一种GCs受体拮抗剂。为了进一步验证GCs参与运动锻炼的抗炎效果,我们把WT和ob小鼠随机分为6组:Sed-WT组(n=7),Ex-WT组(n=7),Ex-WT+RU486 组(n=7),Sed-ob组(n=7),Ex-ob 组(n=7),Ex-ob+RU486组(n=7)。每天注射RU486(30mg/kg/d)或生理盐水,运动方案同上。运动干预结束后收取肺组织,采用ELISA方法检测肺组织炎症细胞因子水平,每周记录一次小鼠体重变化。研究结果第一部分:1.补充外源性H_2S可以改善BLM诱导小鼠肺上皮细胞减少及衰老:免疫荧光显示,与Control组相比,BLM组小鼠肺组织E-cadherin的表达显著减少,p53和p21的表达显著增加;与BLM组相比,BLM+H_2S组小鼠肺组织E-cadherin的表达显著增加,p53和p21的表达显著减少。2.补充外源性H_2S可以改善BLM诱导小鼠肺纤维化:ELISA结果显示,与Control组相比,BLM组小鼠肺组织中羟脯氨酸、I型胶原和TGF-β的含量显著升高(p0.01,p0.01,p0.01);与BLM组相比,BLM+H_2S组小鼠肺组织中羟脯氨酸、Ⅰ型胶原和TGF-β的含量显著降低(p＜0.05,p0.01,p0.01)。3.运动锻炼可以改善BLM诱导的小鼠肺纤维化:HE和Masson染色结果显示,与Control组相比,BLM组小鼠肺组织肺泡壁增厚,结构破坏,胶原沉淀增多;与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织肺泡壁变薄,结构相对完整,胶原沉淀明显减少。ELISA结果显示,与Control组相比,BLM组小鼠肺组织羟脯氨酸、I型胶原及TGF-β的含量均显著升高(p0.01,p0.01,p0.05);与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织羟脯氨酸、I型胶原及TGF-β的含量均,显著降低(p0.01,p0.01,p0.05)。4.运动锻炼增加上皮黏附分子E-cadherin且降低纤维化标志蛋白α-SMA的表达:与Control组相比,BLM组小鼠肺组织E-cadherin表达显著减少(p0.01),α-SMA表达显著增加(p0.01);与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织E-cadherin表达显著增加(p0.01),α-SMA表达显著减少(p0.05)。5.运动锻炼抑制BLM诱导TGF-β信号通路的激活:与Control组相比,BLM组小鼠肺组织p-Smad2、p-Smad3、Smad4表达水平均显著升高(p0.01,p0.05,p0.01);与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织中这三种蛋白表达水平又均显著降低(p0.01,p0.05,p0.01)。6.运动锻炼增加小鼠肺组织中CBS和CSE的表达:与Control相比,BLM组小鼠肺组织CBS和CSE的蛋白表达显著降低(p0.01,p0.01);与BLM组相比,BLM+Ex组小鼠肺组织CBS和CSE的蛋白表达显著升高(p＜0.01 p0.05)。第二部分:1.运动锻炼降低ob/ob小鼠肺组织炎症细胞因子水平:与Sed-WT组相比,Sed-ob组小鼠肺组织炎症介质IL-1β、IL-18和MCP-1水平均显著升高(p0.01,p0.01,p0.01),IL-6无显著性改变;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织炎症状态明显改善,主要表现为IL-β、IL-18和MCP-1水平显著降低(P0.05,p0.05，p0.01)。2.运动锻炼改善ob/ob小鼠肺组织巨噬细胞浸润程度：与Sed-WT组相比,Sed-ob组小鼠肺组织CD68阳性细胞显著增多(P0.01);与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织CD68阳性细胞显著减少(P0.01)。3.运动锻炼降低ob小鼠肺组织MPO活性:与Sed-WT组相比,Sed-ob组小鼠肺组织MPO活性显著升高(P0.01);与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织MPO活性显著降低(P0.05)。4.运动锻炼显著增加小鼠肺组织皮质酮含量,对血浆皮质酮水平无显著性影响:与Sed-WT组相比,Ex-WT组小鼠肺组织皮质酮水平显著升高(P0.05),Sed-ob组小鼠肺组织皮质酮水平显著降低(P0.05);与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织皮质酮含量显著升高(P0.01)。血浆皮质酮水平无显著性改变。5.GCs关键合成酶CYP11B1缺失于小鼠肺组织,且运动锻炼和肥胖并不改变这一现象:免疫组化结果显示,GCs关键合成酶之一 CYP11B1在小鼠肺组织中未见表达,其余关键酶StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP21以及代谢酶11β-HSD1和11β-HSD2在小鼠肺组织中均有表达,且运动锻炼和肥胖均未改变CYP11B1在肺组织中呈阴性表达的结果。6.运动锻炼显著增加小鼠肺组织11β-HSD1的含量:免疫荧光结果显示,与Sed-WT组相比,Ex-WT组小鼠肺组织11β-HSD1的表达显著增加(P0.01),11β-HSD2无显著性变化;与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织11β-HSD1的表达显著增加(P0.01),11β-HSD2无显著性变化。Western blot结果也显示,运动锻炼显著增加11β-HSD1的表达(P0.01),但不影响11β-HSD2的表达。RT-PCR结果与Western blot结果趋势一致,运动锻炼显著增加11β-HSD1的mRNA水平(P0.05),但不影响11β-HSD2的mRNA水平。7.RU486阻断运动锻炼的抗炎效果：与Ex-WT组相比,Ex-WT+RU486组小鼠肺组织中IL-1β、IL-18和MCP-1水平以及MP0的活性均显著升高(P0.05,P0.01,P0.01,P0.05);与Ex-ob组相比,Ex-ob+RU486组小鼠肺组织上述细胞因子水平均显著升高(P0.01,P0.01,P0.05,P0.01)。8.小鼠体重变化:与Sed-WT组相比,Ex-WT组小鼠体重显著下降(p0.05),Ex-WT+RU486组小鼠体重显著升高(p0.05);与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠体重显著降低(p0.01),Ex-ob+RU486组小鼠体重显著升高(p0.01)。9.运动锻炼增加小鼠肺组织CBS和CSE的蛋白表达:与Sed-WT组相比,Sed-ob组小鼠肺组织CBS和CSE的表达均显著下降(p0.01,p0.01);与Sed-ob组相比,Ex-ob组小鼠肺组织CBS和CSE的表达显著升高(p0.01,p0.05)。研究结论运动锻炼通过抑制TGF-β信号通路的激活和促进GCs活性的增强,改善了BLM诱导的小鼠肺纤维化和肥胖相关的肺组织炎症,其可能的机制是运动锻炼促进了小鼠肺组织中H_2S水平的提高。
【学位授予单位】：上海体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R87
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本文编号：1314357
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