益肾蠲痹丸对胶原诱导性关节炎大鼠骨代谢及免疫调节的影响

发布时间：2017-12-23 18:25

本文关键词：益肾蠲痹丸对胶原诱导性关节炎大鼠骨代谢及免疫调节的影响　出处：《北京中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：1研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种炎症介导的慢性自身免疫性疾病,以关节滑膜炎症、血管翳形成及软骨和骨质破坏为主要病理表现,临床常表现为关节痛与压痛、僵直,进展常伴骨质疏松,渐出现关节不可逆的损伤,后期乃至出现关节活动障碍、关节畸形。其发病原因及发病机制尚未阐明。多认为免疫调节紊乱是RA发病的主要机制及重要环节,免疫抑制剂能够起到治疗RA的作用。调节性T细胞(RegulatoryT cells,Tregs)对于改善RA的病情进展及骨质破坏起重要作用。骨代谢指破骨细胞(Osteoclast,OC)与成骨细胞(Osteoblast,OB)之间保持动态平衡,使骨组织不断地得到更新。OC与OB的代谢受免疫系统的调节,前期实验证实Treg可以通过释放IL-10、TGF-β增强其对OC分化的抑制作用。益肾蠲痹丸(YSJB)是中医治疗痹症临床效果显著的中成药,具有温补肾阳、益肾壮督、搜风剔邪、蠲痹通络之功效。临床及实验研究表明YSJB能缓解关节疼痛,延缓RA进程,前期实验研究表明YSJB对胶原诱导性关节炎(Collagen-inducedarthritis,CIA)模型大鼠骨质破坏的进展有抑制作用,但其机制未见研究。本研究旨在探讨YSJB对CIA模型大鼠骨破坏发生中骨代谢及免疫调节的影响。2研究目的从Tregs调控OC分化与成熟的角度探讨YSJB对CIA大鼠骨破坏的影响。3研究内容与方法3.1益肾蠲痹丸对CIA大鼠Treg/Th17平衡及骨破坏的影响雄性SD大鼠40只随机分为4组,空白对照组、CIA模型组、来氟米特(LEF)组和益肾蠲痹丸(YSJB)组。除空白对照组外,其余组大鼠造CIA模型,LEF组和YSJB组分别灌胃给药28d。观察YSJB对CIA大鼠关节炎指数的影响,HE染色评价踝关节病理学改变;流式细胞术(FCM)检测大鼠PLNLs中Treg、Th17、Th1免疫细胞的比例;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中骨代谢指标的活性;采用micro CT的方法分析踝关节局部骨微观结构的变化。3.2益肾蠲痹丸含药血清对OC单独培养及OC-Tregs共培养体系中破骨细胞分化及骨吸收功能的影响无菌分离C57BL/6小鼠双侧股骨、胫骨的骨髓造血干细胞及脾脏,骨髓造血干细胞经M-CSF诱导为破骨前体细胞,加入RANKL诱导其向OC分化;脾脏制备成单细胞悬液,经免疫磁珠分选方法获得CD4+CD25+Tregs。OC+Tregs共培养组按照OC:Tregs=25:1的比例接种于Transwell细胞培养板;组别设置为:OC+正常血清组、OC+CIA模型血清组、OC+LEF血清组、OC+YSJB血清组;OC+Tregs+正常血清组、OC+Tregs+CIA模型血清组、OC+Tregs+LEF血清组、OC+Tregs+YSJB血清组。各培养体系中均预置盖玻片或牛骨片。同时加入不同组别大鼠含药血清;培养7d后抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察OC细胞形态并计算其数量;比色法测定不同组别大鼠含药血清对OC标志物抗酒石酸酸性磷酸酶活性的影响;骨片培养至第10d,经甲苯胺蓝染色,观察OC在其表面形成的骨吸收陷窝的形态,并用Leica Qwin图像分析软件计算骨吸收陷窝面积。4研究结果4.1益肾蠲痹丸对CIA大鼠Treg/Th17平衡及骨破坏的影响免疫后15d大鼠关节炎指数显著增加(P0.01)。与空白对照组比较,造模后大鼠病理积分明显增加(P0.01),踝关节局部骨破坏明显,踝关节表而积BS与BS/BV显著增加(P0.01);反映骨形成的指标BGP、BALP、PICP、PINP明显下降(P0.01),反映骨吸收的指标TRACP、NTX、CTX明显升高(P0.01,P0.05);Th1细胞、Th17细胞明显升高(P0.01,P0.05),Treg细胞明显下降(P0.05)。与模型组比较,经YSJB治疗后,大鼠关节炎指数有降低趋势,关节病理积分明显降低(P0.05),大鼠骨量明显增加(P0.01),踝关节表面积BS与BS/BV明显下降(P0.01,P0.05);经YSJB治疗后,PINP明显上升(P0.05),BGP、PICP有升高的趋势,但没有统计学差异,TRACP、CTX、NTX明显下降(P0.01,P0.05);Th1、Th17细胞明显下降(P0.01,P0.05),Treg细胞明显升高(P0.05)。YSJB能够降低CIA大鼠关节炎指数,减轻关节的病理损伤,改善骨微观结构,同时能调节骨形成和骨吸收指标和PLNLs中Treg、Th17、Th1免疫细胞比例。4.2益肾蠲痹丸含药血清对OC-Tregs共培养体系中OC分化及骨吸收功能的影响与OC+正常血清组相比,OC+Tregs+正常血清组OC分化较小,数目较少,TRAP活性降低,骨吸收面积减少(P0.05),提示Treg有抑制OC分化的作用。与OC+正常血清组相比,OC+CIA模型血清组OC分化体积大、数量多,TRAP活性显著增高,骨吸收陷窝面积增大(P0.01)。与OC+CIA模型血清组相比,OC+YSJB血清组OC分化数目减少,TRAP活性降低,骨陷窝形成面积明显降低(P0.01),YSJB对OC分化有抑制作用。与OC+Tregs+CIA模型血清组相比,OC+Tregs+YSJB血清组OC分化数量明显减少,形成的骨陷窝面积小(p0.01)。提示在Treg介导的共培养环境中,YSJB对OC分化的抑制作用,除直接作用于OC外,还可能通过Treg对OC发挥抑制作用。5结论CIA大鼠关节炎指数升高,关节病理损伤加重,骨微观结构破坏,骨代谢失常,PLNLs中Treg比例下降、Th1和Th17细胞升高,Treg可抑制OC分化及骨吸收功能。益肾蠲痹丸能够降低CIA大鼠关节炎指数,减轻关节的病理损伤,改善骨微观结构,其作用机制之一是通过升高Treg细胞比例,促进Treg抑制OC分化及骨吸收功能。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】