干细胞来源微囊泡在化疗损伤性卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中的作用

发布时间：2017-12-23 20:29

  本文关键词：干细胞来源微囊泡在化疗损伤性卵巢早衰小鼠卵巢功能重建中的作用　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分人脐带间充质干细胞来源微囊泡的分离纯化目的:建立一个高效的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)来源微囊泡的(microvesicles,MVs)分离纯化方法。方法:在无血清条件下培养人脐带间充质干细胞,收集P3-7代干细胞培养液上清,分别采用传统超速离心法、改良超速离心法及蔗糖梯度离心法分离纯化MVs,通过Bradford蛋白定量法比较三种方法MVs获取量,透射电镜鉴定MVs的形态学特征。结果:(1)干细胞的分离提取及培养组织块培养第6-7d,少量细胞从组织块游出,呈多角形;第17-20d,细胞达80%融合,平行排列或旋涡状生长。第3代干细胞为均一长梭形,生长迅速,可稳定传代。(2)微囊泡的分离方法比较及形态特征改良超速离心法所得微囊泡量显著高于传统超速离心及蔗糖梯度离心法(p0.05),每106个干细胞约可获得162.66±17.50μg微囊泡。电镜下MVs呈圆形或椭圆形,直径介于20-200nm之间,中间为低电子密度区。结论:改良超速离心法可获得高蛋白浓度的微囊泡第二部分微囊泡在小鼠卵巢内的定位与分布目的:观察微囊泡经尾静脉注射后在小鼠卵巢内的定位情况。方法:用PKH26标记MVs,将MVs经尾静脉注射入化疗损伤性卵巢早衰小鼠及正常小鼠体内,12h、24h、48h、72h、1w取出卵巢,冰冻切片,FSHR及DAPI免疫荧光染色,共聚焦显微镜下观察MVs在正常小鼠及化疗损伤小鼠卵巢内的分布与定位。结果:PKH26标记的MVs(PKH26-MVs)尾静脉注射后12h即可在损伤卵巢卵泡膜层见少量红色荧光信号,24h后损伤卵巢红色荧光信号显著增多,与正常卵巢相似,48h后损伤卵巢内荧光信号达到最强,卵泡内的颗粒细胞呈现红色荧光,表明微囊泡已被颗粒细胞摄取。72h后损伤卵巢内荧光强度仍未衰减。1w后两组卵巢内仅见少量荧光残留。结论:MVs经尾静脉注射后,12h即可进入卵巢组织,并可被颗粒细胞摄取;随时间延长大量分布于正常及化疗损伤小鼠卵巢内。第三部分微囊泡在化疗损伤性小鼠卵巢功能重建中的作用及机制目的:探讨脐带间充质干细胞来源微囊泡对化疗药物损伤性卵巢早衰小鼠卵巢功能的影响及机制。方法:将实验动物分为三组:建模对照组、正常对照组和建模移植组。通过一次性腹腔注射环磷酰胺(CTX)200mg/kg和白消安(BUS)20mg/kg建立卵巢早衰小鼠模型。将MVs经尾静脉注射入建模移植组小鼠体内,并取等量PBS经尾静脉注射至建模对照组和正常对照组小鼠体内,每周重复1次。每日阴道涂片HE染色观察小鼠动情周期变化,并观察小鼠体重变化。适宜条件下饲养4周后,卵巢组织石蜡切片HE染色观察并计数卵泡及血管,ELISA法检测血清性激素变化,免疫组化法检测并计数黄体CD34+内皮细胞,q PCR法检测卵巢组织血管生成相关基因VEGF、IGF-1、Angiogenin的表达水平,Western Blot法检测卵巢组织血管生成相关蛋白VEGF以及血管相关信号通路相关蛋白Akt及p-Akt的表达水平。结果:(1)化疗药物损伤性卵巢早衰小鼠模型建立建模组小鼠在注射CTX及BUS期间动情周期紊乱、卵巢间质纤维化严重,各级卵泡与正常对照组相比明显减少(p0.05),损伤卵泡比例显著增加(p0.05)。血清E2水平显著降低(p0.05),FSH水平显著升高(p0.05)。(2)小鼠一般情况建模对照组小鼠行动缓慢,喜弓背蜷缩,体毛晦暗无光泽,体重随着时间明显下降(p0.05),动情周期紊乱。建模移植组小鼠在MVs注射后2周动情周期逐渐恢复,至移植后4周75%的小鼠恢复正常动情周期,体重显著增加(p0.05)。(3)卵巢组织学观察建模对照组小鼠卵巢组织结构紊乱,血管明显减少,间质纤维化严重,卵母细胞碎裂、溶解,颗粒细胞排列紊乱,各级卵泡数均显著低于正常对照组(P0.05)。建模移植组小鼠卵巢组织切片可见各级卵泡,卵母细胞形态均一,颗粒细胞放射状层叠排列,间质血管丰富,间质纤维化明显改善,各级卵泡数均显著高于建模对照组(p0.05)。(4)血清FSH和E2水平测定与建模对照组相比,建模移植组小鼠血清E2水平显著增加(p0.05),FSH水平显著降低(p0.05)。(5)血管及CD34阳性内皮细胞计数建模移植组小鼠卵巢血管数及黄体CD34阳性细胞数均显著高于建模对照组(p0.05),但仍显著低于正常对照组(p0.05)。(6)血管相关基因的m RNA表达水平q PCR法显示建模移植组小鼠卵巢血管相关基因VEGF、IGF-1、angiogenin的m RNA表达水平均显著高于建模对照组(p0.05)。(7)促血管生成相关蛋白表达水平Western Blot法显示建模移植组小鼠促血管生成相关蛋白VEGF、Akt及p-Akt的表达水平均显著高于建模对照组(p0.05)。结论:(1)单次腹腔注射环磷酰胺(CTX)200mg/kg及白消安(BUS)20mg/kg可建立稳定的小鼠卵巢早衰模型。(2)微囊泡能部分改善化疗药物对卵泡的损伤,改善卵巢的内分泌功能。(3)微囊泡通过激活PI3K/AKT信号通路,使促血管生成相关因子生成增加,促凋亡物质减少,促进血管增生,改善卵巢微循环,从而对化疗损伤的卵巢起到修复及保护作用
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R711.75

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本文编号：1325385