TGF-β及其受体信号通路在氟调控破骨细胞分化中的作用

发布时间：2018-01-07 14:16

本文关键词：TGF-β及其受体信号通路在氟调控破骨细胞分化中的作用　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:转化生长因子-β(TGF-β)作为转化生长因子超家族中的多功能细胞因子,其产生于细胞分化的各个阶段,在骨组织中的含量尤为丰富。TGF-β可以由骨中的许多细胞产生并分泌在骨基质中,研究证明了TGF-β在破骨细胞的分化和骨的重吸收过程中发挥重要的作用。在氟骨症发病过程中,氟能够刺激成骨细胞和破骨细胞,均表现出不同程度的活跃性,但是对于在骨的重吸收过程中发挥主要作用的破骨细胞研究甚少。本实验从体内、体外两个方面进行研究,探究TGF-β在氟调控的破骨细胞中的作用,这在以往的氟骨症机制研究中罕见报道。本实验研究成果将为氟骨症及相关代谢性骨病的研究提供线索和理论依据。实验方案:1.体内实验:60只清洁级雄性成年Wistar大鼠平均分为对照组、低氟组和高氟组。三组大鼠给予氟处理1个月后,每组中选取一半的大鼠进行SB431542试剂处理,实验最后分为6组:对照组,10mg F-/kg·day组,20mg F-/kg·day组,SB431542组,10mg F-/kg·day+SB431542组,20mg F-/kg·day+SB431542组。投氟联合SB431542继续处理1个月后,乙醚麻醉处死大鼠,经眼球取血进行生化分析,收集股骨、胫骨等骨组织进行HE染色、免疫组化和酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分析。我们主要观察了氟中毒大鼠骨组织的病理形态、骨保护素蛋白表达以及成骨、破骨标志物水平。该实验主要考察氟中毒大鼠复制氟骨症模型、骨转换特征和TGF-β受体抑制剂对氟骨症骨吸收病理过程的影响。2.体外实验:我们以小鼠单核细胞系RAW264.7为研究对象,采用培养基加RANKL(25ng/m L)诱导单核细胞融合成破骨细胞前体,作为考察氟诱导破骨细胞增殖和分化的体外模型。实验设为对照组,1、4、16mg F-/m L三个梯度氟组以及SB431542组和三个梯度氟联合SB431542组,共8组。RAW264.7细胞在RANKL存在的条件下,分别给予氟浓度分别为0,1,4,16 mg F-/m L,以及氟联合抑制剂SB431542(浓度为10μmol/L)进行处理,培养7天后进行实验检测。采用MTT法检测不同条件下的细胞活性;将RANKL诱导RAW264.7细胞接种在骨磨片上,培养7天后,对骨片进行甲苯胺蓝染色,光镜下观察各组形成骨陷窝的形态并进行不同条件下破骨细胞样细胞骨吸收能力的比较分析;利用实时聚合酶链式反应和蛋白杂交技术分别检测了暴露于不同条件下RAW264.7细胞内破骨相关及TGF-β信号通路各因子在基因和蛋白水平的表达变化。3.mi RNA表达分析:RAW264.7细胞在RANKL存在的条件下,给予氟浓度8mg F-/L培养液处理7天。采用Affymetrix mi RNA 4.0芯片进行染氟组与对照组细胞mi RNA表达谱分析,利用Volcano Plot filtering观察mi RNA基因表达量的变化,与对照组比较倍数改变值≥2.0或≤-2.0即为明显差异表达的mi RNA。最后用层次聚类法分析明显差异基因的表达框架。实验结果:1.体内实验:投氟大鼠随着投氟时间延长和投氟量的加大,氟斑牙病损和骨转换活跃状态更加显著。SB431542联合氟处理组大鼠的氟斑牙损害程度比相同投氟条件下大鼠牙齿损害加重,但是骨组织病理性骨转换特征被抑制。与之相对应的是氟能够促进大鼠血清内PINP和CTX的浓度提高,而单独SB431542处理显著抑制了两者的表达;氟降低了大鼠的骨密度,而且高氟组大鼠明显比低氟组大鼠骨密度低,骨密度变化情况与前面的病理结果相互支持。此外,大鼠骨组织抑制破骨关键因子OPG蛋白表达明显降低,SB431542促进骨髓B细胞前体表达OPG。大鼠暴露于不同氟水平能够引起活跃骨转换,造成不同程度的成骨和破骨活动加强。SB431542作为TGF-β1细胞内受体抑制剂能够抑制骨转换,明显影响氟引起的骨转换状态,说明TGF-β1在氟刺激的骨转换机制中扮演着重要角色。2.体外实验:结果表明低量氟显著刺激RAW264.7细胞活性,高量氟早期也能促进该细胞活性,但是随着氟作用时间的延长,细胞活性受到抑制。同样地,低量氟对RAW264.7细胞诱导破骨细胞骨吸收能力和破骨细胞分化特征的细胞数具有显著的刺激作用,高氟却抑制这种作用。经过破骨细胞分化标志物TRAP和调控因子RANK表达在染氟破骨细胞样细胞内的变化,证明了氟对破骨细胞分化成熟的刺激作用,并且伴随着TGF-β1细胞内两个受体及其下游磷酸化Smad3的表达。然而,氟对破骨细胞样细胞的刺激作用在联合给予TGF-β1细胞内受体抑制剂SB431542后显著下降;相应地,磷酸化Smad3和TβR1的表达比单独氟作用组细胞明显降低。这些结果提示了TGF-β1在氟作用破骨细胞分化和功能机制中有着重要作用。3.mi RNA芯片分析:结果显示出染氟能够促进破骨细胞前体细胞内的诱导细胞分化及参与调控的IGF1和TGF-β1等的mi RNA表达显著增加。我们知道每个mi RNA可以有多个靶基因,而几个mi RNAs也可以调节同一个基因。在本实验经过KEGG富集分析发现了氟刺激了多个参与调控破骨细胞分化信号通路,如IGF1和TGF-β1及其细胞内下游信号因子Smad3、MAPK等的mi RNA变化。结论:低量氟对破骨细胞活性、分化和功能具有显著的刺激作用,高氟作用一定时间后却能抑制这种刺激作用,并阻碍破骨细胞的分化和功能。TGF-β1在氟作用破骨细胞分化和功能机制中有着重要作用,氟很可能通过TGF-β1细胞内的TβR1-磷酸化Smad3信号通路发挥这种刺激作用。同时,氟可以同时刺激破骨细胞内多个参与调控破骨细胞分化信号通路,如IGF1和TGF-β1及其细胞内下游信号因子Smad3、MAPK等的mi RNA变化,这为我们下一步分析氟诱导破骨精细调控机制提供了线索。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R599.1

【参考文献】