早期非小细胞肺癌中寻找与鉴定异常DNA甲基化的基因启动子及其和突变的关系研究

发布时间：2018-01-08 02:29

本文关键词：早期非小细胞肺癌中寻找与鉴定异常DNA甲基化的基因启动子及其和突变的关系研究　出处：《华东师范大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一。早检测、早治疗是战胜肺癌的关键。DNA甲基化谱式异常是肺癌早期事件之一。这些大量的DNA甲基化修饰的改变可以作为一种潜在的生物标志物运用到肺癌临床早期检测中从而提高肺癌患者的生存率。另一方面,DNA甲基化的异常对肺癌的发生、发展、预后、耐药性等方面有重要的影响。所以肺癌早期DNA甲基化异常的研究对肺癌形成的分子机制、寻找诊断指标和预后判断指标有重要的临床意义。随着近几年高通量测序技术的发展,我们有可能在全基因组水平精确检测DNA甲基化的变化。本课题采用简化代表性重亚硫酸盐测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)方法探寻肺癌早期样本中DNA甲基化的异常。首先,我们寻找到了 4775个差异甲基化CG二核苷酸位点,根据聚类分析我们发现这些差异CG位点的甲基化水平能完全区分肺癌肿瘤样本和癌旁样本,这预示着DNA甲基化谱式改变是肺癌发生发展的关键事件之一。在这些差异甲基化CG位点中,低甲基化位点(hypomethylated-CG)明显多于高甲基化位点(hypermethylated-CG),这与肿瘤中整体DNA甲基化降低和局部甲基化升高的报道是吻合的。进一步分析发现hypermethylated-CG中含CpG岛的启动子(CpGi-promtoter)占 24%,而 hypomethylated-CG 中 CpGi-promoter 仅占 13.16%,表明高甲基化的CG位点集中在含CpG岛的启动子区域。后续我们以差异甲基化片段(DMR)的分析方法对启动子区的甲基化异常进行了研究。在6对肺癌样本中同时出现高甲基化的启动子区DMR 一共9个,包括了 PTTG1IP、DRICH1和AC139103.1等基因的启动子区。我们对PTTG1IP基因的启动子区甲基化进行了深入研究,扩大样本研究验证了 PTTG1IP启动子在肺癌肿瘤组织和细胞系中高甲基化,而且PTTG1IP基因在肿瘤组织和细胞系中低表达,启动子区DNA甲基化水平和表达量呈负相关。通过使用5-aza-CdR降低肺癌细胞系A549的DNA甲基化水平,我们验证PTTG1IP启动子区甲基化下降与其表达量上升直接相关。进而我们在A549细胞中过表达PTTG1IP,发现细胞生长受到明显抑制。综合这些结果我们推测PTTG1IP在肺癌中通过启动子区高甲基化抑制表达,减少了对肺癌细胞的抑制,可能是早期肺癌中一个肿瘤抑制基因。另一方面,我们通过KEGG和GO分析发现甲基化变化剧烈异常区域主要集中在与细胞增殖、分化、凋亡等有关的mTOR和MAPK信号通路中。说明在肺癌早期这些通路的部分基因已发生异常。因为肿瘤的发生和发展过程中遗传学和表观遗传学异常调控同时存在,为了进一步阐明突变与DNA甲基化修饰在肺癌中的作用关系,我们利用RRBS数据进行了突变分析。本研究根据亚硫酸盐转化DNA测序数据中单核苷酸变异判断标准开发了应用于RRBS数据的肿瘤特异性变异(Tumor specific variants,TSV)的生物信息筛选流程。我们筛选到高频突变的基因共计364个,主要富集在磷脂酰肌醇信号通路中。同时我们还发现TP53等已知肿瘤相关基因启动子区也存在突变。为了验证DNA高甲基化和突变之间的普遍关系,是否存在突变引起DNA甲基化改变导致基因沉默,我们利用筛选到的突变频率在0.4-0.6的TSV分析突变和甲基化之间的关系。通过研究我们发现A-G和T-C这两种TSV突变类型会造成reads整体甲基化变化幅度加大。其他类型的突变对reads整体甲基化没有影响。此外,我们还发现TSV发生区域临近CG位置甲基化要明显低于邻近区域,并且X-A(X为T、G、C)和X-T(X为A、G、C)六种突变后造成临近突变位点CG甲基化下降,相对甲基化变化高达到7%。综上所述,通过TSV和所在位点甲基化的研究揭示了在肿瘤中表观遗传和经典遗传学之间存在一定的相互影响。但是这种联系在肿瘤的发生和发展中最终起到怎样的作用还需要进一步的研究。
[Abstract]:In this study , we found that the methylation level of DNA methylation in lung cancer was significantly higher than that of hypermethylation . In this study , we found that the methylation level of CpG islands in lung cancer was significantly higher than that of hypermethylation . In conclusion , the methylation of TSV and site methylation revealed that there was a certain interaction between apparent inheritance and classical genetics in the tumor . But this association also needed further research in the genesis and development of the tumor .

【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】