西瑞香素对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制作用和在细胞中的代谢研究

发布时间：2018-01-10 02:17

本文关键词：西瑞香素对神经母细胞瘤细胞的增殖抑制作用和在细胞中的代谢研究　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:神经母细胞瘤是一种罕见的恶性肿瘤,高发于5岁以下的儿童。目前能够治疗该疾病的药物很少,所以寻找有效药物很有必要。西瑞香素(Daphnoretin),化学名7-为羟基-6-甲氧基-3,7'-双香豆素酯,又称双白瑞香素,具有以醚键结合的双香豆素类衍生物的结构,在菊科、瑞香科等植物中均有发现。研究发现西瑞香素具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗焦虑等药理作用,所以本实验采用该药物进行研究,探索其能否对神经母细胞瘤细胞有效。目的:通过进行神经母瘤细胞SH-SY5Y的增殖抑制、凋亡、周期实验,研究该化合物是否对神经母瘤细胞起作用。建立神经母细胞瘤细胞中西瑞香素的HPLC检测方法,通过西瑞香素在神经母瘤细胞中的摄取和消除实验为西瑞香素的细胞药代动力学研究提供初步的理论依据。探索西瑞香素能否成为治疗人神经母细胞瘤的药物,为治疗该疾病提供帮助。方法:采用经典的MTT(四氮唑盐)法,计算西瑞香素对神经母细胞瘤细胞不同给药浓度下的存活率,来评价西瑞香素对肿瘤细胞的增殖抑制作用。标记了FITC的AnnexinV可以作为荧光探针结合早期凋亡神经母细胞瘤细胞上的磷脂酰丝氨酸,PI(碘化丙啶)核酸染料可以与凋亡中晚期细胞和坏死细胞的细胞核结合,两种染料同时使用可将早期凋亡和晚期、坏死的细胞区分开,实验采用荧光显微镜观察不同浓度西瑞香素对神经母细胞瘤细胞的凋亡情况的影响。采用PI染色法对给药细胞进行染色,用流式细胞仪检测西瑞香素对神经母瘤细胞周期的影响。用JC-1染色法检测西瑞香素对细胞线粒体膜电位的影响。采用细胞划痕实验检测西瑞香素对神经母细胞瘤细胞的迁移能力的影响。建立细胞内西瑞香素的HPLC含量测定方法,并对方法学进行验证。然后用建立的方法测定在一定时间内,细胞对西瑞香素的摄取和消除情况,研究血清和维拉帕米对西瑞香素在SH-SY5Y细胞中含量是否有影响。结果:MTT试验结果表明,西瑞香素对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y有增殖抑制作用。神经母瘤细胞的凋亡实验结果表明西瑞香素能够诱导细胞的凋亡,浓度为10μg/mL时,主要诱导细胞早期凋亡,随着给药浓度的增加晚期和坏死细胞数量增加。细胞周期试验显示,给药后神经母细胞瘤细胞在S期的比例升高,说明西瑞香素能够阻滞细胞周期,主要是阻滞细胞由S期向G2期的进行。JC-1染色法实验结果表明西瑞香素能够降低线粒体膜电位,进一步验证西瑞香素能够诱导神经母细胞瘤细胞发生凋亡。细胞划痕实验证明西瑞香素对神经母细胞瘤细胞的迁移能力也有影响。细胞药代动力学方法学试验结果:用Phenomenex C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-磷酸水溶液(55:45,v/v,pH≈3.0),流速1.0 mL/min。检测波长345 nm,柱温30 0C分离效果良好。本方法在0.02-20.0μg·mL-1内线性关系良好,最低定量限为0.05μg·mL-1,标准线性方程为Y=80620X+5962,R2大于0.99。低、中、高3个质量浓度1.0,5.0,10.0μg·mL-1的西瑞香素第一天的日内精密度的RSD分别是:9.34%,2.97%,2.24%;第二天的日内精密度是9.55%,2.27%,4.60%;第三天的日内精密度为6.35%,1.54%,2.74%;日间精密度是8.91%,2.41%,3.61%。准确度的RSD值是5.69%,6.11%,3.35%;室温立即处理、在室温放置24h、4℃放置24h稳定性实验结果分别是14.85%,6.03%,8.29%;11.97%,3.16%,5.54%;11.11%,4.67%,5.02%。提取回收率不同浓度的提取回收率的RSD值分别为:2.18%,1.65%,3.49%。所有RSD%均小于15%,说明建立的HPLC方法学可用。超声裂解结果表明裂解30 min检测药物含量最高。西瑞香素的摄取量与时间相关随着时间的增加摄取量增加,在6-8h达到稳态,并且在含血清状态下西瑞像素的摄取量比在无血清状态下的摄取量高。消除实验结果显示,西瑞香素在细胞中的消除随着时间逐渐减少。加入10μM、50μM的维拉帕米与不含维拉帕米组的细胞中西瑞香素的量没有显著性差异,说明西瑞香素转运过程中不存在P-糖蛋白的外排作用。讨论:实验发现该药对神经母细胞瘤细胞有一定的增殖抑制作用,能够诱导细胞凋亡,对细胞周期和迁移能力也有一定的影响。本实验建立的西瑞香素细胞样品检测的HPLC方法效率高、专属性高、灵敏度较好,可对细胞药动学研究提供方法学的依据。西瑞香素在细胞中的摄取和消除作用研究,可为探索西瑞香素在细胞内的作用机制打下基础。
[Abstract]:Objective : To study the effect of ciresinol on the cell cycle of neuroblastomas by means of MTT ( MTT ) method .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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