新型小分子化合物WJ460抑制黑色素瘤增殖与迁移及其分子机制研究

发布时间：2018-01-16 03:25

  本文关键词：新型小分子化合物WJ460抑制黑色素瘤增殖与迁移及其分子机制研究　出处：《华东师范大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：黑色素瘤是一种恶性皮肤肿瘤,是由黑色素细胞过度增殖引起的,由于其极高的转移性和增殖能力,黑色素瘤的治愈率极低。在皮肤癌所有的死亡的病例中,黑色素瘤的死亡病例占所有的皮肤癌死亡总数的80%。近年来由于环境恶化以及其他因素的影响,黑色素瘤在世界范围内的发病率和死亡率都在持续增加。黑色素瘤的高转移性是治疗黑色素瘤最大的障碍,因此寻找能够抑制黑色素瘤转移和增殖的药物是当前黑色素瘤研究的重点所在。本实验室其他课题组的研究发现含有2,3-二芳香基噻唑啉酮结构的化合物会具有较好的抗肿瘤细胞迁移和侵袭的作用,进而以该结构为基础,设计并合成了一系列靶向抑制肿瘤细胞迁移的小分子化合物。我们利用黑素瘤细胞B16F10进行体外划痕实验,对得到的化合物进行筛选,最终确定了对黑色素瘤迁移抑制效果最好、最稳定的小分子化合物WJ460。在体外的细胞实验中,我们通过划痕愈合实验、trans-well侵袭实验验证了WJ460确实可以浓度依赖性抑制黑色素瘤细胞迁移,并且通过荧光染色发现WJ460可以改变黑色素瘤细胞的形态。在体内动物实验中,我们通过尾静脉注射黑色素瘤细胞B16F10建立了肿瘤肺转移模型,之后通过腹腔注射WJ460进行治疗,实验结果证明WJ460能够有效抑制黑色素瘤的肺转移。而后我们进一步探究该化合物作用的分子机制,实验结果表明,WJ460可以有效抑制与细胞转移和上皮细胞间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相关的分子在转录和蛋白水平的表达,包括N-cadherin,E-cadherin,基质金属蛋白酶MMP-9,Vimentin,Slug,Twist 等。此外,我们发现 WJ460 可以有效抑制 ERK1/2,MEK1/2,GSK-3β的磷酸化以及β-catenin的表达,从而抑制了 MAPK和Wnt/β-catenin两条信号通路的活性,并可能是通过这两条信号通路抑制了 EMT相关转录因子的表达。而且我们通过用EGF和Wnt3a作为激活剂,验证了 WJ460的确能够抑制这两条信号通路起到抗肿瘤的作用。在验证过程中我们发现这两条信号通路之间有相互作用,通过EGF刺激不仅促进了 ERK1/2的磷酸化,也可以使β-catenin的表达上升;而同时用EGF和WJ460处理细胞发现,WJ460可以阻断由于EGF介导引起的β-catenin的增加。另外,Wnt3a刺激不仅能促进β-catenin的表达,也可以激活ERK1/2的磷酸化,而再加入WJ460后,可以抑制β-catenin和P-ERK1/2的表达,这说明WJ460可能通过抑制MAPK和Wnt信号通路的表达,从而抑制黑色素瘤的转移。综上所述,我们的研究证明新型小分子化合物WJ460具有良好的抗黑色素瘤转移和增殖的效果,能够在细胞和动物水平抑制黑色素瘤细胞迁移和侵袭,并且能够抑制肿瘤细胞的EMT相关转录因子的表达。此外,本论文证明化合物WJ460可能通过抑制黑色素瘤细胞内的MAPK和Wnt信号通路发挥抗肿瘤的作用。本研究不仅为WJ460治疗黑色素瘤提供了实验依据,研究结果还表明新型小分子化合物WJ460作为治疗黑色素瘤的备选化合物将具有很好的临床应用前景。
[Abstract]:Melanoma is a malignant tumor of the skin, caused by excessive proliferation of melanoma cells, because of its high metastasis and proliferation of melanoma, the cure rate is very low. In all skin cancer deaths, melanoma deaths accounted for all skin cancer deaths 80%. in recent years due to the deterioration of the environment and other factors, the melanoma incidence and mortality in the world is on the rise. High metastatic melanoma, melanoma is the biggest obstacle to treatment, thus finding drugs can inhibit the transfer and proliferation of melanoma is the focus of melanoma research where the other. Laboratory research group found that compounds containing 2,3- two aromatic thiazolinone structure will have good resistance to the invasion and migration of tumor cells, and then based on the structure, design and A series of small molecules to inhibit tumor cell migration target synthesis. We use B16F10 melanoma cells in vitro scratch test, the compounds have been screened, and ultimately determine the best inhibitory effect on the migration of melanoma, the most stable small molecule WJ460. in in vitro in our healing through scratches. Trans-well invasion experiment proved that WJ460 can concentration dependent inhibition of melanoma cell migration, and by fluorescence staining indicated that WJ460 can change the morphology of melanoma cells. In vivo animal experiments, we injected through the tail vein of melanoma cells B16F10 tumor metastasis model was established by intraperitoneal injection, after WJ460 treatment. The experimental results show that WJ460 can effectively inhibit the lung metastasis of melanoma. Then we further explore the compound effect. Sub mechanism, the experimental results show that WJ460 can effectively inhibit the metastasis and cell and epithelial mesenchymal transition (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) expression of related molecules in transcription and protein levels including N-cadherin, E-cadherin, matrix metalloproteinase MMP-9, Vimentin, Slug, Twist and so on. In addition, we found that WJ460 can effectively inhibit ERK1/2. MEK1/2, GSK-3 beta phosphorylation and -catenin expression, thus inhibiting MAPK and Wnt/ beta -catenin two pathway, and may be through the two signal pathway inhibited the expression of EMT related transcription factors. And we through using EGF and Wnt3a as activator, WJ460 can inhibit this verification two signal pathways play a role in anti-tumor. In the process of verification, we found that the interactions between these two signaling pathways by EGF stimulation not only promote ERK1/2 Phosphorylation, also can make the expression of beta -catenin increased; while EGF and WJ460 cells showed that WJ460 could block due to increased EGF mediated by beta -catenin. In addition, the stimulation of Wnt3a can promote the expression of beta -catenin, can also activate the phosphorylation of ERK1/2, and then after joining WJ460, expression can inhibit the beta -catenin and P-ERK1/2, indicating that WJ460 may be through inhibiting expression of MAPK and Wnt signaling pathway, thereby inhibiting the metastasis of melanoma. In summary, our study demonstrated that a novel small molecule compound WJ460 has good anti melanoma metastasis and proliferation effect, can inhibit melanoma cell migration and invasion in cell and animal level, the expression of EMT related transcription factor and can inhibit tumor cell. In addition, this paper proves that compound WJ460 may inhibit melanoma cells in the MAPK and Wnt signals This pathway not only provides experimental evidence for the treatment of melanoma by WJ460, but also indicates that WJ460, a new small molecule compound, will have a good clinical application prospect as an alternative compound for melanoma.

【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.5

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本文编号：1431353