肠出血性大肠杆菌耐酸相关新基因的筛选与鉴定

发布时间：2018-01-18 11:26

  本文关键词：肠出血性大肠杆菌耐酸相关新基因的筛选与鉴定　出处：《广西医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：EHEC O157:H7是致病性大肠杆菌最具代表性的一种血清型,是一种食源和水源性致病菌,历史有数次食源性暴发,感染来源通常是食用牛粪便污染的食物,感染量极低。可引起出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒症(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP),严重可致命。目前针对EHEC感染仍没有良好的治疗药物,志贺毒素是其最重要的毒力决定簇,在引发HC和HUS中有非常重要的作用;其他的毒力因子如黏附素、Ⅲ型分泌系统效应分子、溶血素等在EHEC的感染与定植中都有着十分重要的作用;EHEC的耐酸因子是另一种重要的毒力因子,在EHEC生存和侵袭中发挥了重要作用,维持EHEC在发酵食品和酸性食品中的生存,帮助细菌顺利通过胃酸环境而进入肠道定植感染,还有研究表明酸处理后的EHEC增加了黏附上皮Hep-2和Ca Co2细胞系的能力和细胞凋亡。大肠杆菌有复杂的耐酸系统,这使得大肠杆菌可以适应多种酸性环境压力,可以在极端的p H环境中生存数小时。目前随着对普通非致病性大肠杆菌耐酸机制研究的深入,发现了一系列新的耐酸相关的基因及调控子,逐步揭示大肠杆菌复杂的耐酸网络。相比较普通大肠杆菌,EHEC有着更为复杂的耐酸系统和更好的耐酸能力,其基因组上特有的O岛编码了一系列环境适应能力相关的分子,需要进一步挖掘和鉴定。应用转录组学研究策略有助于发掘一些新的耐酸相关基因和调控子,拓展我们对细菌酸调控系统的认识。本文针对EHEC EDL933菌株,通过胃酸环境p H2.5分别处理菌株15min 30min 45min以未处理组为对照组,对动态时间点的菌株开展转录组学研究,运用生物信息学分析绘制细菌酸应答表达谱,系统研究了本研究中激活的耐酸相关的通路和分子,发现了膜蛋白在EHEC耐酸应答中的重要作用及磷酸戊糖途径的下调等,并从中筛选出参与耐酸应答网络的17个潜在新基因z0168 z0474 z0602 z2088 z2163 z2211 z2272 z2328 z2716 z3132 z3919 z3963 z3971 z4286 z5466 z5751 z1075。进一步从实验验证的角度,应用Red重组技术在EHEC EDL933菌株中分别单敲除z0168 z0474 z0602等潜在耐酸新基因,成功构建13个缺失突变株(不包括z2088 z2716 z3132 z4286),进一步通过体外模拟胃酸p H2.5的实验体系,初步验证了yad S yai W yba Q等基因在极端酸环境中对于维持EHEC EDL933生存有重要作用。一、耐酸调控网络分析及潜在耐酸基因的筛选通过体外模拟胃酸环境(p H2.5)处理EHEC EDL933菌株,首先对处理后菌株的基因表达进行转录组学研究,得到了以下的结果:1、筛选出不同处理时间点(15min 30min 45min)共有的差异表达基因262个,其中104个基因上调,已注释基因主要包括转录调控子、结构蛋白、离子运输蛋白、酶等多与压力相关;在158个下调的基因中,主要有代谢相关蛋白、酶和转录调控子;2、KEGG富集分析显示已知的功能基因主要富集在代谢相关通路中,如碳水化合物代谢和次级代谢产物合成等,其中碳代谢中下调的4个关键基因均参与磷酸戊糖途径;3、耐酸系统中AR3通路明显被激活,涉及两个最重要的调控基因adi A、adi Y和最终的反转运体Adi C;4、检测到被激活的已报道耐酸相关的重要基因:adi Y mnt H fpr fnr cue O csp D csp H omp R等;5、细胞壁脂多糖合成、膜及相关蛋白的多个基因高表达;6、检测到与已报道相一致的酸应答相关的氧化损伤、厌氧呼吸、冷激、饥饿、渗透压、锰离子吸收、PTS系统部分基因被激活。7、结合文献、Blast软件结果及蛋白互作网络、q PCR验证,最终筛选出17个可能参与酸应答的潜在新基因(z0168 z0474 z0602等),用于实验表型验证,利用17个基因所在的家族和可能的功能注释进一步将其定位在可能参与的酸应答通路中。二、酸应答潜在新基因对EHEC环境适应能力的影响针对已经筛选出的17个目的基因,我们用Red重组技术进行敲除,成功构建13株相应的缺失突变株。首先检测了不同缺失株的生长曲线,结果显示:缺失突变株除了Δz5751生长较野生株稍慢,其余与野生株生长曲线并没有明显差异,说明敲除的目的基因并不影响EHEC EDL933菌株的生长。进一步我们对不同缺失株的抗逆环境能力进行检测,如强酸环境(p H2.5的酸性培养基,培养2h)、在高盐环境(6%Na Cl,16h)及高温(65℃,10min)LB培养基下的存活情况,以野生株为对照。结果显示:所有的缺失株的酸耐受能力均有十分显著的下降(下降在几十倍至数百倍之间),高盐环境下只有部分缺失株表现出生存率较野生株稍低(下降在1~3倍之间),而高温环境下缺失株与野生株生存率没有明显的统计学差异,说明所敲除的这些目的基因与EHEC的极端酸环境中生存密切相关,而对高盐、高温逆环境下EHEC的生存并没有大的影响,初步说明了基因yad S yai W yba Q z2088 yde H yde M ydc Z ydb H ydi K mtf A ECs3486 csi R yga C yqg D yii R yje K ybj M可能直接或间接参与到EHEC菌株对极端酸环境的应答,为进一步的深入研究这些基因的功能及作用机制奠定了基础。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378.21
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本文编号：1440740