Shh信号通路对髁突肥大软骨细胞凋亡活性影响的研究

发布时间：2018-01-19 18:47

本文关键词： 颞下颌关节髁突软骨髁突肥大细胞凋亡 Sonic hedgehog　出处：《第四军医大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：髁突肥大(Condylar hyperplasia,CH)是发生于青少年的一种具有自限性的单侧髁突过度生长性疾病,无性别差异,常导致患者面部偏斜和咬合紊乱,从而影响美观和咀嚼。髁突肥大的确切发病机制未明,关于其治疗方式目前仍以髁突高位切除术为主。因此,针对髁突肥大病因开展基础研究,有助于探索新的治疗方式,从而在疾病的早期阻断其发生,减轻或避免手术带来的创伤。大量临床证据和组织学证据已证实患侧髁突的生长活跃是髁突肥大的主要病因。髁突软骨是髁突的生长中心,其生长过程包括软骨细胞的增殖、分化、肥大及凋亡等重要过程。本课题组前期研究发现,与正常髁突软骨细胞相比,髁突肥大软骨细胞的增殖能力显著升高。但是关于髁突肥大软骨细胞的凋亡活性变化对髁突肥大病理进程的影响目前尚未见相关报道。经查阅文献发现,在正常软骨的生长发育过程中,Shh信号通路发挥着至关重要的作用。Shh信号通路的主要成分包括配体Shh,膜受体Ptc和Smo以及转录因子Gli等。Tavella S等研究发现,过表达的Shh信号通路能够抑制小鼠肢体关节软骨的凋亡。而且Shh信号能够通过介导PI3K/AKT或ERK进而来调控细胞的凋亡。但是Shh信号通路对髁突肥大软骨细胞凋亡活性的影响尚未明晰,因此,本研究拟探究Shh信号通路在髁突肥大软骨中的表达情况,并验证Shh信号通路对髁突肥大软骨细胞凋亡活性的影响以及潜在的分子机制。实验一、软骨组织标本的收集和软骨细胞的分离培养实验方法:1,标本来源:正常髁突软骨标本来至于第四军医大学口腔医院髁突骨折手术患者(骨折块无法固定),髁突肥大软骨标本源于武汉大学口腔医院SPECT阳性的髁突肥大手术患者;2,组织标本的处理:选取结构完整的正常髁突软骨标本及髁突肥大软骨标本各3例,常规多聚甲醛固定,EDTA脱钙;3,软骨细胞的分离培养:利用酶消化法分离培养软骨细胞;收集第二代软骨细胞,转藻酸盐微珠三维培养,以防止软骨细胞的去分化。实验结果:在平板培养状态下,软骨细胞形态多为多角形、三角形,少数呈圆形或短梭形,细胞集聚生长成簇,呈“铺路石”样外观。藻酸盐三维培养状态下微珠呈水滴状或圆形,软骨细胞呈圆球形亮点状散在分布。实验结论:利用机械和酶联合消化法能够获得细胞活性较高的髁突软骨细胞。实验二、Shh信号通路在髁突肥大软骨细胞的表达变化情况实验方法:1,选取正常髁突软骨及髁突肥大软骨组织标本各3例,利用免疫组化染色检测Shh及其膜受体Smo在两组软骨中的表达情况;2,在三维培养的第21天分别收集正常软骨细胞及髁突肥大软骨细胞,提取总蛋白及RNA,然后利用Western blotting及Real-time PCR分别从蛋白及基因水平检测Shh及Smo在两组软骨细胞中的表达情况。实验结果:免疫组化染色结果显示,髁突肥大软骨中Shh和Smo均呈异常高表达,且主要集中于未分化间充质层和肥大层。与正常髁突软骨细胞相比,髁突肥大软骨细胞中Shh和Smo蛋白和基因的表达水平均显著增高(P0.05)。实验结论:Shh信号通路在髁突肥大软骨中呈异常高表达。实验三、Shh信号通路对髁突肥大软骨细胞凋亡活性的影响实验方法:将软骨细胞随机分为三组:正常髁突软骨细胞组(NC组)、髁突肥大软骨细胞组(CH组)及Cyclopamine(Smo受体阻断剂)刺激肥大软骨细胞组(CH+Cyclo组),在三维培养的第5、12、19天分别向CH+Cyclo组添加Cyclopamine刺激48h,分别提取总蛋白及RNA,然后利用Western blotting和Real-time PCR检测Cleaved-caspase3在三组细胞中的表达情况。实验结果:与NC组相比,CH组中Cleaved-caspase3基因及蛋白的表达水平均显著降低(P0.05),添加Cyclopamine阻断Shh信号通路之后,Cleaved-caspase3基因及蛋白的表达水平均显著升高(P0.05)。实验结论:Shh信号通路能够抑制髁突肥大软骨细胞的凋亡。实验四、Shh信号通路对软骨细胞凋亡活性影响的机制研究实验方法:将软骨细胞随机分为4组:CH组、CH+Cyclo组、LY294002刺激髁突肥大软骨细胞组(CH+LY294002组)及U0126刺激髁突肥大软骨细胞组(CH+U0126组)。在三维培养的第5、12、19天分别用Cyclopamine、LY294002(PI3K/AKT阻断剂)及U0126(MAPK/ERK阻断剂)刺激细胞48h,于第21天分别提取总蛋白和RNA,然后利用Western blotting检测Cleaved-caspase3、AKT、ERK、P-AKT及P-ERK的表达变化情况,并用Real-time PCR检测Cleaved-caspase3 m RNA的表达情况。实验结果:与CH组相比,CH+Cyclo组中AKT及ERK均无明显变化(P0.05),但其磷酸化状态P-AKT及P-ERK的表达却显著降低(P0.05)。与CH组相比,CH+LY294002刺激组和CH+U0126刺激组中Cleaved-caspase3基因与蛋白的表达水平均明显降低(P0.05)。实验结论:Shh能够活化PI3K/AKT及MAPK/ERK这两条通路,并通过介导PI3K/AKT和MAPK/ERK通路来抑制髁突肥大软骨细胞的凋亡。
[Abstract]:In this study , it has been found that the growth of condylar cartilage is the main cause of condylar hypertrophy . The experimental results showed that the expression level of the gene and protein in condylar cartilage was significantly higher than that of normal condylar cartilage cells ( P0.05 ) . The experimental results showed that the expression of the gene and protein in condylar cartilage were significantly decreased by using the method of Western blotting and Real - time PCR . and the apoptosis of the condylar hypertrophy chondrocytes was inhibited by mediating the 3 - K / ERK and MAPK / ERK pathways .

【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R782

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