丹参茎叶资源化学研究及心血管活性评价

发布时间：2018-02-04 01:45

  本文关键词： 丹参 丹参茎叶 资源化学 基因表达 活血化瘀　出处：《南京中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：本论文共分为五章内容。第一章文献研究分别从丹参本草考证、丹参资源品种与分布、丹参中化学成分及药理活性研究和丹参的生长及采收规律等方面综述了丹参药用资源的研究概况。通过对近年来丹参地上部分资源性化学成分及其药理活性研究进行归纳分析,并探索性提出其资源利用价值与利用途径,以期为丹参资源的系统利用及产业化开发提供依据和参考。基于丹参基因组学、转录组学及代谢组学等方面近年来的研究进展,对丹参酚酸类成分的生物合成途径、关键酶基因与调控机制,以及丹参酚酸类成分生物转化利用现状等进行归纳分析,以期为丹参酚酸类物质资源的高效生产与资源综合利用提供科学依据。第二章丹参资源化学研究1、采用UPLC-TQ/MS联用技术测定不同采收期丹参不同部位中丹酚酸类、丹参酮类、黄酮类及三萜类成分的含量,结果表明,在整个生长期内,丹参根部丹酚酸类成分含量呈"M"形的变化趋势,在春季出苗期(4～5月)和地上部分生长旺盛期(7～8月)达到最高(6.598%),丹参酮类成分在翌年返青时含量较高,最高为0.716%。丹参地上部分资源性化学成分种类丰富且含量可观,可作为获取丹参酚酸类化学成分的新资源,对其适宜采收期的确定还需要根据实际需求加以评价,若以丹酚酸类成分为主要功效物质基础作为评价指标时,应选择7-8月份丹参地上部分生长旺盛时为最佳采收期。2、采用HPLC-ELSD法测定不同采收期丹参不同部位(根、茎、叶和花)中糖类成分含量,主要为果糖、葡萄糖、蔗糖和水苏糖,分析了这4种糖类成分在丹参不同部位、不同生长时期的变化规律。结果发现,丹参根中富含水苏糖,且在冬季地上部分枯萎时含量最高(29.97%)。丹参茎中单糖(果糖和葡萄糖)分别在枯萎期及出苗期含量最高,双糖(蔗糖)和低聚糖(水苏糖)则在7月份地上部分生长旺盛期积累量最高。丹参叶中单糖(果糖和葡萄糖)则在春季5月份含量最高,分别为3.73%、4.62%,而双糖(蔗糖)和低聚糖(水苏糖)则在7月份地上部分生长旺盛期,光合作用最强时积累量最高。丹参花中单糖类化合物在5月中旬盛花期时积累量最高,其中果糖为6.91%、葡萄糖为5.20%,双糖和低聚糖积累量达到最高时为6月中下旬末花期。3、采用UPLC色谱系统,"中药色谱指纹图谱相似度评价系统"(国家药典委员会2004A版)建立对照图谱和进行相似度评价,SPSS 19.0进行主成分分析和聚类分析。建立并比较了丹参、丹参茎叶中水溶性丹酚酸类成分UPLC特征指纹图谱,同时分析评价7种丹酚酸类成分(丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A)。结果表明,丹参及其茎叶水提物指纹图谱具有一定相似性,相似度最高可达0.981,共有化学成分主要为丹酚酸类成分。定量分析表明不同批次丹参、丹参茎叶中丹酚酸类成分含量存在一定差异,但丹酚酸类成分的种类组成相一致。4、采用UPLC色谱系统构建丹参茎叶的指纹图谱,同时应用相似度评价、聚类分析和主成分分析(PCA)对实验数据进行分析,获得丹参茎叶醇提物UPLC特征图谱,共有峰13个。各批次丹参茎叶的相似度为0.823～0.997,聚类分析、PCA结果与相似度分析结果一致。丹参茎叶UPLC指纹图谱的构建和化学模式的识别为其质量控制和丹参非药用部位利用价值的挖掘提供了科学依据。第三章丹参不同生长期不同部位关键酶基因表达与活性成分积累相关性分析1、通过荧光定量PCR技术研究丹参不同组织中参与丹酚酸类和丹参酮类成分生物合成的关键酶基因在不同生长期的表达情况,包括参与丹酚酸类合成的五个关键酶基因(SmPAL1、Sm4CL1、SmHPPR、SmRAS和SmCYP98A14)和参与丹参酮合成的五个关键酶基因(SmAACT、SmDXR、SmGGPPS、SmCPS和SmKSL)。参与合成丹参根中丹酚酸类成分的关键酶基因,相对表达量较高的主要为SmCYP98A14、SmPAL1和Sm4CL1,其中SmCYP98A14为迷迭香酸合成下游途径的关键酶,在花期(5月)和地上形态稳定期(8月)表达量达到最高。SmPAL1在茎和花中的相对表达量在5月和8月最高,SmHPPR在茎中表达量较低,而在叶中的表达主要在地上部分生长后期(7～9月),在丹参花中,除SmHPPR在4月和5月未检测到,各基因的表达总体呈先降后升的趋势。丹参根中SmDXR在整个生长期表达量呈递减趋势,SmGGPPS主要在4～9月表达量相对较高,且在9月达到峰值。2、采用UPLC-TQ/MS技术对不同生长期丹参不同部位中各丹酚酸及丹参酮类化合物进行动态变化研究,结合qPCR技术研究丹参根、茎、叶和花中参与丹酚酸类和丹参酮类化合物生物合成的关键酶基因在不同生长期的表达情况,并采用统计学软件建立基因表达量和成分积累的关联性。结果显示,SmPAL1作为丹酚酸类成分合成途径中苯丙氨酸支路的第1个关键酶基因,与丹参根中迷迭香酸含量相关性较大,相关系数r为0.430,其次为丹酚酸B和总酚酸。在丹参茎中,SmPAL1基因与原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸A含量显著负相关(P0.05),丹参叶中仅SmHPPR与紫草酸的合成存在极显著正相关(P0.01)。SmHPPR和SmCYP98A14在丹参花中与丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A及总酚酸含量皆存在负相关,且与迷迭香酸和总酚酸量积累存在极显著负相关(P0.01)。丹参根中SmDXR、SmGGPPS和SmKSL与丹参新酮的合成或积累存在正相关。第四章丹参茎叶活血化瘀效应评价1、基于寒凝血瘀模型,以丹参茎叶和丹参水提物及醇提物为研究对象,通过观察丹参茎叶及丹参不同部位不同剂量对血瘀大鼠血液流变学及凝血功能的影响,并采用多指标综合指数法和PCA法综合评价丹参茎叶及丹参的总活血化瘀效应。研究表明高剂量丹参醇提物活血化瘀效应最佳,能显著改善血瘀大鼠血液流变学和凝血功能指标,同时,丹参茎叶水提物高剂量组亦具有良好活血化瘀效应,其总活血效应值仅次于低剂量丹参醇提物,证实了丹参茎叶活血化瘀、改善血液循环的药理活性,具有潜在药用价值。通过观察丹参茎叶及丹参不同部位不同剂量对血瘀大鼠炎症因子(TNF-α和IL~(-1)β)、内源性活性因子(TXB2和6-keto-PGF1α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平的变化,结果表明,与空白组比较,模型组大鼠TNF-α、IL~(-1)β、TXB2和iNOS水平升高,6-keto-PGF1α水平降低(P0.05,0.01),各给药组中TNF-α、IL~(-1)β和iNOS水平均降低,且接近正常组水平。与模型组比较,各给药组可降低TXB2的量(P0.05,0.01),升高6-keto-PGF1α的量,提示丹参茎叶和丹参发挥活血化瘀作用的机制可能为抑制炎症因子分泌,保护血管内皮功能变化等,为丹参茎叶作为新药源得以开发利用提供科学依据。2、通过体外试验,以血浆凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白原(FIB)为评价指标,探讨7月份丹参茎叶水提物和醇提物(SY-7、CY-7)、12月份丹参茎叶水提物和醇提物(SY~(-1)2、CY~(-1)2)及丹参水提物和醇提物(SG、CG)对家兔凝血功能的影响。研究表明,丹参茎叶和丹参醇提物对家兔体外抗凝血作用强于其水提物,作用较强的指标为TT,作用大小为CGCY-7CY~(-1)2,且与空白组比较均具有显著性差异(P0.01)。三者均不能延长凝血酶原时间(PT),对活化部分凝血活酶时间(APTT)而言,作用大小顺序为CY-7CGCY~(-1)2。对家兔体外纤维蛋白原(FIB)的影响,CGCY-7CY~(-1)2。此外,丹参茎叶醇提物(CY-7)与丹参根醇提物(CG)相比,体外抗凝血作用无显著差异。3、以清除DPPH自由基、清除ABTS自由基和还原Fe3+能力为药效评价指标,比较丹参7月份茎叶、12月份茎叶和丹参根的水提物及醇提物抗氧化活性大小,同时结合UPLC-TQ/MS技术对其化学组分进行定性定量分析。研究表明,丹参地上茎叶作为丹参非传统药用部位,具有较强的体外抗氧化能力,其中7月份丹参茎叶水提物抗氧化、清除自由基能力最强,清除DPPH和ABTS自由基的EC50分别为19.14μg·mL-L~(-1)和9.24μg·mL~(-1),其富含水溶性丹酚酸类成分,以丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B为主。通过对这4种主要单体化合物进行体外抗氧化评价,发现活性最强的为咖啡酸,对DPPH和ABTS自由基清除率分别为4.76μg·mL~(-1)和2.65 μg·mL~(-1)。第五章丹参茎叶对HUVECs的保护作用及其机制1、体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察丹参茎叶及丹参水提物和醇提物对过氧化氢(H202)诱导HUVECs损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。以H202(6.06 mmol.L~(-1))损伤HUVECs 2 h建立损伤模型,并设Vc为阳性对照,采用MTT法检测丹参茎叶及丹参水提物、醇提物以及丹参中代表性丹酚酸、黄酮和丹参酮类化合物(迷迭香酸、丹酚酸B、芦丁、异槲皮苷和隐丹参酮)对HUVECs细胞增殖率的影响,采用试剂盒检测细胞上清液中GSH-Px、CAT、NO和ET~(-1)含量。结果显示,丹参茎叶醇提物(CJ)、丹参醇提物(CG)、丹参茎叶水提物(SJ)和丹参水提物(SG)在一定浓度下对H2O2诱导的HUVECs损伤具有保护作用,活性最强的为CJ,浓度为50 μg.L~(-1)时,保护率为46.01%。与模型组比较,各提取物高、中、低剂量组细胞上清中分泌的GSH-Px、CAT和NO含量升高,ET~(-1)分泌降低(P0.05,0.01),且呈现一定的量效关系。2、选取人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象,建立高糖诱导的HUVECs氧化损伤模型,并以不同浓度的丹参茎叶及丹参水提物、醇提物、阳性药氨基胍以及丹参中代表性丹酚酸、黄酮和丹参酮类化合物(迷迭香酸、丹酚酸B、芦丁、异槲皮苷和隐丹参酮)进行干预,MTT法检测各给药组HUVECs存活率,相关试剂盒测定NO、ICAM~(-1)和TNF-α的含量变化。结果表明,与对照组相比,模型组HUVECs氧化应激作用明显增强,提取物中对HUVECs保护作用最强的为丹参茎叶醇提物(CJ),高剂量浓度为50μg·mL~(-1)时,保护率为67.23%。给药后各指标均向正常组回归,揭示丹参茎叶及丹参提取物通过降低ICAM~(-1)和TNF-α水平,增加NO含量,从而改善高糖诱导氧化应激对HUVECs的损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285
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本文编号：1488951