糖酵解抑制剂对胃癌细胞MGC-803的影响及其机制研究

发布时间：2018-03-04 01:09

本文选题：3-溴丙酮酸　切入点：柠檬酸钠　出处：《广西医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：【目的】:探讨糖酵解抑制剂3-溴丙酮酸(3-Bromopyruvate,BP)和柠檬酸钠(Sodium citrate,SCT)抑制胃癌细胞MGC-803生长和增殖的作用及其机制,为3-溴丙酮酸和柠檬酸钠进行临床试验和进一步胃癌治疗提供实验依据。【方法】培养低分化人胃癌细胞株MGC-803,并随机分为8组,即3-溴丙酮酸低、中、高浓度组(4、6、8ug/ml),柠檬酸钠低、中、高浓度组(5、10、20mmol/L),阳性对照5-Fu组(0.5mmol/L)以及空白对照组(Control)。经过不同浓度的BP和SCT作用后,用MTT法检测细胞对BP和SCT的敏感性;流式细胞技术检测BP和SCT对细胞凋亡率以及细胞周期分布的影响,酶联免疫法检测糖酵解途径关键酶己糖激酶(Hexokinase,HK)和磷酸果糖激酶-1(Phosphofructokinase-1,PFK-1)的活性、乳酸含量和三磷酸腺苷(ATP)水平的变化,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测细胞内Bcl-2、bax、Cyt-C和Suvivin等基因的mRNA相对表达量,蛋白印迹法(Western blot)检测细胞内Bcl-2、Bax、Cyt-C和Suvivin等蛋白相对表达量。【结果】1.BP和SCT分别对胃癌细胞MGC-803分别作用后,细胞的增殖抑制率均随着BP和SCT作用浓度的增大呈增高的趋势,且随药物作用时间的增大呈增高的趋势。BP和SCT对胃癌细胞MGC-803作用48h的IC50分别为5.73±0.75ug/ml和10.08±0.87mmol/L。镜下观察每个视野内,BP和SCT各浓度组和5-fu组细胞总数比空白对照组少,而形态变圆、出现核固缩的细胞比空白对照组多,且呈浓度依赖的趋势。2.流式细胞技术检测结果显示,不同浓度的bp分别对胃癌细胞mgc-803作用24h、48h后,其凋亡率从10.67%增加到76.19%,与空白对照组相比,具有显著性差异(p0.05)。同时,不同浓度的sct分别对胃癌细胞mgc-803作用24h、48h后,其凋亡率从15.61%增加到83.10%,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(p0.05)。5-fu组24h、48h的凋亡率分别为50.52%和86.06%,与空白对照组相比,均具有显著性差异(p0.05);此外,bp对胃癌细胞mgc-803作用24h后,随着bp浓度的增大,其细胞周期阻滞在g2/m期的细胞比例从14.49%增加到39.39%,而sct对胃癌细胞mgc-803作用24h后,随着sct浓度的增大,其细胞周期阻滞在g2/m期的细胞比例从13.51%增加到41.24%,与空白对照组相比,均具有显著性差异(p0.05)。5-fu组细胞周期阻滞在g2/m期的细胞比例为21.93%,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(p0.05)。3.bp和sct均能有效地降低胃癌细胞mgc-803内atp和乳酸的生成。不同浓度的bp分别对胃癌细胞mgc-803作用4h、8h后,细胞内atp含量从30.79umol/gprot减少到7.31umol/gprot,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(p0.05);而不同浓度的sct分别对胃癌细胞mgc-803作用4h、8h后,细胞内atp含量从28.24umol/gprot减少到6.76umol/gprot,与空白对照组相比,具有显著性差异(p0.05)。5-fu组4h、8h细胞内atp含量分别为20.21umol/gprot和10.34umol/gprot,均比空白对照组显著降低(p0.05)。此外,不同浓度的bp分别对胃癌细胞mgc-803作用24h、48h后,细胞内乳酸含量从84.91umol/gprot减少到18.92umol/gprot,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(p0.05);而不同浓度的sct分别对胃癌细胞mgc-803作用24h、48h后,细胞内乳酸含量从78.87umol/gprot减少到11.44umol/gprot,与空白对照组相比,具有显著性差异(p0.05)。5-fu组24h、48h细胞内乳酸含量分别为106.45umol/gprot和113.98umol/gprot,与空白对照组无显著性差异(p0.05)。4.bp和sct能够分别选择地抑制胃癌细胞mgc-803内hk和pfk-1的活性。不同浓度的bp分别对胃癌细胞mgc-803作用24h、48h后,细胞内hk的活性从8.67u/gprot降低到1.98u/gprot,与空白对照组相比,差异具有统计学意义(p0.05);而不同浓度的sct分别对胃癌细胞mgc-803作用24h、48h后,细胞内hk活性均无明显变化,与空白对照组相比,差异无统计学意义(p0.05)。5-fu组24h、48h的细胞内hk活性分别为11.45u/gprot和10.99u/gprot,与空白对照组无显著性差异(p0.05)。此外,不同浓度的sct分别对胃癌细胞mgc-803作用24h、48h后,细胞内pfk-1的活性从19.01u/gprot降低到2.51u/gprot,与空白对照组相比,具有显著性差异(p0.05),而不同浓度的bp分别对胃癌细胞mgc-803作用24h、48h后,细胞内pfk-1的活性均无明显变化,与空白对照组相比,差异无统计学意义(p0.05)。5-fu组24h、48h的细胞内pfk-1活性分别为25.31u/gprot和27.79u/gprot,与空白对照组无显著性差异(p0.05)。5.bp和sct均能抑制胃癌细胞mgc-803内bcl-2和survivin基因的mrna和蛋白的表达,其相对表达量均随着bp和sct作用浓度的增大呈降低的趋势。此外,bp和sct均能呈浓度依赖性地促进胃癌细胞mgc-803内bax和cyt-c基因的mrna和蛋白的表达。5-fu也能有效地抑制胃癌细胞mgc-803内bcl-2和survivin基因的mrna和蛋白的表达,促进bax和cyt-c基因的mrna和蛋白的表达,与空白对照组相比,具有统计学差异(p0.05)。【结论】bp和sct对人胃癌细胞mgc-803的生长和增殖均有较强的抑制作用。可能是bp和sct分别通过选性地抑制胃癌细胞mgc-803内hk和pfk-1的活性从而抑制糖酵解的效率,使得细胞内atp含量生成减少,同时bp和SCT均下调抗凋亡基因Bcl-2和Suvivin的表达,而上调促凋亡基因Bax表达,激活线粒体通路,促进Cyt-C的释放增加,从而抑制胃癌细胞的生长和增殖、诱导胃癌细胞发生凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】