转录因子Twist1在PPARγ介导的脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用研究

发布时间：2018-03-17 02:09

本文选题：Twist　切入点：1　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的:流行病学研究表明,胰岛素抵抗(IR)与糖尿病、高血压、肥胖症等多种代谢性疾病密切相关,是疾病发生的"共同土壤"。本课题旨在探讨转录因子Twist 1在脂肪细胞胰岛素抵抗中的表达水平、对胰岛素敏感性的影响以及其与过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)的调控关系,明确Twist 1基因在PPARγ介导的脂肪细胞胰岛素抵抗中的作用,为胰岛素抵抗相关疾病的预防和治疗提供相应靶点。研究方法:1.临床标本收集:选择2016-2017年在山东省千佛山医院进行择期手术的患者,按照体重指数(BMI)和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)将研究对象分为对照组和肥胖型IR组。术中收取患者皮下脂肪组织,提取脂肪组织中的RNA,荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术分析转录因子TWIST 1和PPARγ的转录水平。提取皮下脂肪组织中的蛋白,Western blot检测分析转录因子TWIST 1和PPARγ蛋白水平。2.脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立及鉴定:体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,一定方法诱导前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,通过油红O染色鉴定脂滴。应用高糖/高胰岛素诱导法建立脂肪细胞的IR模型,通过葡萄糖消耗实验、葡萄糖摄取实验及葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的免疫细胞化学染色实验鉴定IR模型。模型建立成功后提取脂肪细胞核蛋白,检测Twist 1和PPARγ在脂肪细胞IR模型中的蛋白表达水平。3.转录因子Twist 1的表达对胰岛素敏感性的影响:慢病毒颗粒转染3T3-L1成熟脂肪细胞,分别以感染了阴性病毒颗粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪细胞为对照,分析干扰和过表达转录因子Twist 1对脂肪细胞胰岛素敏感性的影响。4.转录因子Twist 1的表达对脂肪细胞中PPARγ表达的影响:慢病毒颗粒转染3T3-L1成熟脂肪细胞,分别以感染了阴性病毒颗粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪细胞为对照,分析干扰和过表达Twist 1对PPARγ表达的影响。5.PPARγ表达变化对脂肪细胞中Twist 1的影响:PPARy激动剂吡格列酮(0.1μmmol/L)和抑制剂T0070907(100 μmmol/L)作用于诱导分化的成熟脂肪细胞,检测PPARγ表达变化对Twist 1表达的影响。研究结果:1.以对照组皮下脂肪组织中转录因子TWIST 1和PPARγ转录水平为100%,肥胖型IR组脂肪组织中TWIST 1和PPARγ的转录水平分别下调了 41%和28%,具备统计学差异(P0.05)。2.以对照组患者的皮下脂肪组织中转录因子TWIST 1和PPARy的蛋白水平为100%,肥胖型IR组皮下脂肪组织中的TWIST 1和PPARγ表达水平均显著下调,半定量结果显示TWIST 1和PPARγ蛋白表达水平分别下调了 26%和20%,下调水平有统计学差异(P0.05)。3.3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化为成熟脂肪细胞后,油红O染色显示诱导分化成熟的脂肪细胞浆内聚集大量呈橘红色的脂滴,而未被诱导分化的前体细胞油红O染色未着色。以胰岛素未刺激状态下葡萄糖消耗和摄取量为100%,对照组细胞的刺激组葡萄糖消耗是未刺激组的2倍,刺激组葡萄糖摄取量是未刺激组的3.1倍,具有统计学差异(P0.05)。高糖/高胰岛素建立IR模型后,胰岛素刺激组葡萄糖消耗是未刺激组的1.1倍,刺激组葡萄糖摄取量是未刺激组的1.3倍,没有统计学差异(P0.05)。但胰岛素刺激状态下的对照组细胞和IR组相比较,IR组细胞的葡萄糖消耗和葡萄糖摄取较对照组下调了 46%和59%,存在显著差异(P0.05)。低浓度胰岛素刺激建立的胰岛素抵抗细胞模型,IR组脂肪细胞膜上的GLUT 4免疫荧光强度明显弱于对照组。提取脂肪细胞核蛋白,Western blot检测发现在3T3-L1脂肪细胞IR模型组中的转录因子Twist 1和PPARy蛋白表达水平是对照组的2.2倍及1.6倍,存在统计学意义(P0.05)。4.以感染了阴性病毒颗粒NC-LV3的脂肪细胞为对照,干扰Twist 1后其相应蛋白表达水平显著下调了 50%,半定量结果显示下调水平具有明显差异(P0.05)。慢病毒转染成熟脂肪细胞后建立IR模型,胰岛素作用下的Twist 1-/IR组脂肪细胞葡萄糖消耗和葡萄糖摄取分别上调到NC-LV3/IR组的1.5倍和2倍,有统计学差异(P0.05),免疫细胞化学染色也显示Twist1-/IR组细胞膜上的GLUT 4分子数量较NC-LV3/IR组有增加。5.以感染了阴性病毒颗粒NC-LV5的脂肪细胞为对照,过表达Twist 1后其蛋白表达水平显著上调了 40%,半定量结果显示上调程度有统计学意义(P0.05)。慢病毒转染成熟脂肪细胞后建立IR模型,与NC-LV5/IR组细胞相比,胰岛素作用后的Twist 1+/IR组的葡萄糖消耗和葡萄糖摄取以及细胞膜上GLUT 4荧光均无显著差异,无显著的统计意义(P0.05)。6.分别以感染了阴性病毒颗粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪细胞为对照,Twist 1-组的3T3-L1成熟脂肪细胞中PPARγ蛋白表达水平较对照组下调36%,半定量分析下调程度有统计学差异(P0.05),Twist 1+组PPARγ表达水平上调25%,半定量分析上调程度也有显著差异(P0.05)。7.PPARγ激动剂吡格列酮组与对照组比较,其Twist 1蛋白表达水平上调,半定量显示上调63%,上调程度有统计学差异(P0.05),而抑制剂T0070907组相较于对照组,Twist 1表达水平显著下调了 77%,半定量分析有明显差异(P0.05)。研究结论:转录因子Twist 1在胰岛素抵抗中呈现高表达,干扰Twist 1表达可明显改善脂肪细胞胰岛素抵抗水平,且Twist 1和PPARγ在胰岛素抵抗中存在一定的正向调控关系。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R58

【参考文献】