HepG2细胞对HCV core免疫应答过程中ZIP8作用的初步研究

发布时间：2018-03-25 12:29

  本文选题：ZIP8　切入点：丙型肝炎病毒　出处：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究背景:丙型肝炎病毒(HCV)感染被认为是慢性肝炎的主要原因。慢性丙型肝炎患者首先发展为慢性性炎症,导致肝硬化(20-40%),随后(4-6%的患者)发展成肝细胞癌(感染后的10-40年)。目彰肝细胞癌的发病机制尚不明确,其与HCV相关性仍然存在争议,研究表明HCV蛋白可加强致癌转化。HCV-RNA基因编码多聚蛋白前体,可经病毒自身蛋白酶和宿主细胞作用后生成病毒体结构蛋白(核心蛋白和糖蛋白E1和E2)和非结结构(NS)蛋白(p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B)。在体内HCV核心蛋白(HCVcore)可通过各种信号途径来介导免疫反应,促使炎症的发生。锌转运蛋白通过调节锌离子流入,流出和分布到细胞器中,来维持细胞内的锌稳态,包括免疫系统的稳态。锌转运蛋白包括两个蛋白家族:ZIPs(SLC39)和ZnTs(SLC30)。ZIPs转运蛋白使细胞质内锌离子含量升高,ZnTs转运蛋白使细胞质内锌离子含量降低,SLC39A8基因编码的ZIP8属于ZIPs蛋Qg白族。Begum等人研究发现在人类免疫刺激的单核细胞和分化的巨噬细胞中,ZIP8转运蛋白高水平表达。在Z1P8转染的细胞中,ZIP8主要定位于溶酶体上。研究显示,锌离子以ZIP8依赖的方式调节人体巨噬细胞中LPS介导的免疫反应,ZIP8敲除后会抑制在LPS驱动下的细胞内锌离子的积累,并使IL-10在mRNA水平上的表达升高。ZIP8通过调控Zn2+参与骨关节炎的发病机制。此外,ZIP8可通过NF-κB信号途径来负反馈调节促炎反应。钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)属于蛋白磷酸酶2B家族,依赖于Ca2+/钙调素(CaM)调节,分布于许多哺乳动物器官。前期研究发现,在体外LPS刺激下CaN可以通过NF-κB信号途径来调节炎症因子的释放,如:IL-2,NO。在CaN催化结构域中,二价金属离子如:Zn2+和Fe2+为必要元素,并且在体外可被Mn2+和Ni2+激活。研究目的:检测正常人,丙肝患者和治愈后丙肝患者外周血单个核细胞(PBMCs)中ZIP8 mRNA的表达情况,探讨慢性丙型肝炎与ZIP8的关系。通过ZIP8过表达、RNA干扰和缺锌、加锌处理HepG2细胞来探讨HepG2细胞对HCV core免疫应答过程中ZIP8的作用。实验方法:1.临床标本收集正常人(n=28),丙型肝炎患者(n=39),治愈后丙型肝炎患者(n=49)血液标本,用qRT-PCR方法来检测ZIP8 mRNA的表达。2.HCV core对HepG2细胞ZIP8表达的影响培养HepG2细胞,脂质体转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-HCV core质粒,24h后收集细胞,用qRT-PCR和Western blot方法检测ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表达。3.ZIP8在HCV core免疫应成答过程中的作用(1)ZIP8、HCV core表达载体共转染HepG2细胞,设为三组:Vector、HCVc和HCVc+ZIP8,转染24h后,收集细胞。(2)ZIP8RNA干扰转染HepG2细胞,48h后,转染HCVcore表达质粒,分为三组:Vector+NCsi、,HCVc+NCsi 和 HCVc+ZIP8si,继续培养 24h 后,收集细胞。4.ZIP8通过调控Zn2+在HCVcore免疫应答过程中的作用(1)用 2.5μM TPEN、50μM ZnCl2 预处理 HepG2 细胞 lh,然后转染 HCV core 表达载体,设为四组:Vector、HCVc、HCVc+ZrnCl2 和 HCVc+TPEN,继续培养24h后,收集细胞(2)ZIP8 RNA 干扰转染 HepG2 细胞,48h 后,用 50μM ZnCl2预处理 HepG2细胞lh,然后转染HCV core表达载体,设为四组:Vector+NCsi、HCVc+NCsi、HCVc+ZIP8si 和 HCVc+ZIP8si+ZnCl2,继续培养 24h 后,收集细胞。以上收集的细胞用于提取RNA,细胞内蛋白,胞内核蛋白,进一步用qRT-PCR检测NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表达。用Western blot检测IKKβ、p-IKKβ以及核蛋白p-NF-KBp65在蛋白水平上的表达。5.ZIP8和Zn2+对CaN活性的影响提取各组细胞内蛋白,用CaN试剂盒检测各组CaN活性。6.细胞内锌含量的测定用锌离子荧光探针来检测 HCVc、HCVc+ZIP8、HCVc+ZrnCl2、HCVc+TPEN、HCVc+ZlP8si和HCVc+ZIP8si+ ZnCI2,这六组实验组组中细胞内锌离子含量。实验结果:1.临床标本与正常对照组相比,ZIP8 mRNA表达水平征在丙型肝炎患者中显著降低;在治愈后丙肝患者中无明显差异。与丙肝患者相比,ZIP8 mRNA在治愈后的丙肝患者中表达显著升高。2.HCV core 上调 HepG2 细胞 ZIP8 的表达与对照组相比,HCV core能够显著增加ZIP8在mRNA和蛋白水平上的表达。3.ZIP8在HCV core免疫应答过程中的作用qRT-PCR结果显示:ZIP8过表达能够显著降低NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-αa在mRNA水平上的表达;ZIP8RNA干扰能够显著升高NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-α在mRNA水平上的表达。Western blot结果显示:ZIP8过表达能够显著降低IKKβ、p-IKKβ和核内p-NF-KBp65在蛋白水平上的表达。ZIP8 RNA干扰能够显著升高IKKβ、p-IKKp和核内P-NF-κBP65在蛋白水平上的表达。4.ZIP8通过调控Zn2+在HCV core免疫应答过程中的作用qRT-PCR结果显示:50μMZnCl2加锌处理能够使NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著降低;2.5μM TPEN缺锌处理能够使NF-KBp65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著升高;当ZIP8被敲除后,50μM ZnCl2加锌处理同样能够使NF-κBP65、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达水平显著降低。Wstern blot结果显示:50μM ZnCl2加锌处理能够显著降低IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-KBp65在蛋白水平上的表达;2.5μM TPEN缺锌处理能够显著升高IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-KBp65在蛋白水平上的表达;当ZIP8被敲除后,50μM ZnCl2加锌处理同样能够显著降低IKKβ、p-IKKβ以及细胞核内p-NF-κBp65在蛋白水平上的表达。5.ZIP8和Zn2+对CaN活性的影响ZIP8过表达能够显著抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高;ZIP8 RNA干扰能够显著诱导CaN活性的升高;50μM ZnCl2加锌处理能够显著抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高;2.5μM TPEN缺锌处理能够显著诱导CaN活性的升高·,当ZIP8被敲除后,50μM ZnCl2加锌处理同样能够显著抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高。由此可见,ZIP8可通过调控Zn2+来抑制由HCV core诱导的CaN活性的升高。6.细胞内锌含量的测定HCVc+ZIP8和HCVc+ZrnCl2对应于对照组HCVc荧光强度明显增强;HCVc+ZIP8si和HCVc+TPEN对应于对照组HCVc荧光强度明显减弱;HCVc+ZIP8si+ZnCl2对应于对照组HCVc+ZIP8si荧光强度明显增强。结论:1.临床标本结果显示:与正常对照组相比,ZIP8mRNA表达水平在丙型肝炎患者中显著降低;在治愈后丙肝患者中无明显差异。推测ZIP8可能与HCV感染有一定的联系。2.体外实验显示,ZIP8过表达和Zn2+可显著抑制由HCV core诱导的炎症因子表达的上调,NF-κB以及CaN活性的升高,而沉默表达ZIP8和缺锌处理则呈现出相反的结果。由此可见,ZIP8可通过调控Zn2+抑制炎症的发生,具体的机制有待进一步研究。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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本文编号：1663133