TIPE2-ER Stress信号通路在脑缺血再灌注炎症损伤中的作用机制研究

发布时间：2018-04-03 00:24

本文选题：脑缺血再灌注损伤　切入点：TIPE2　出处：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:缺血性脑血管疾病严重威胁人类健康、影响生活质量,并有逐年递增的趋势,是现代社会致死、致残的最主要的疾病之一,已经成为严重影响老年人健康的常见疾病。但由于其发病机制尚不清楚,对其防治带来困难。临床和动物实验表明血管再通后的再灌注损伤(Ischemia-Reperfusion Injury,IRI)在缺血性脑血管疾病的进程中发挥关键作用,多种因素参与到了这个过程。炎症反应在脑缺血再灌注中的作用受到了越来越多的关注,适度的炎症反应可以清除坏死的组织,但过强的炎症反应可引起脑组织的进一步损伤。因此,深入研究脑缺血再灌注损伤过程中的免疫调控机制,找到免疫调节信号通路中的关键信号分子,将为预防及治疗缺血性脑损伤提供新的靶点,具有重要的理论意义和临床应用价值。肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TumorNecrosis Factor-α-Induced Protein 8-Like2,TIPE2/TNFAIP8L2)是于2008年发现并鉴定的新基因,属于TNFAIP8家族,研究表明TIPE2参与多种肿瘤及炎症相关疾病的发生发展过程,其主要功能是抑制炎症和诱导凋亡。课题组前期结果明确了 TIPE2通过抑制炎症细胞的浸润和炎症因子的产生,在脑缺血再灌注损伤中起到免疫负调控及保护作用,因此TIPE2有望成为缺血性脑血管疾病治疗的新靶点,但目前对TIPE2在脑缺血再灌注炎症中发挥免疫负调控作用的具体机制尚不清楚。内质网是细胞内蛋白修饰的重要场所,当细胞受到缺血、氧化应激等刺激时,启动未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR),其首要目标是清除应激状态下产生的大量未折叠蛋白,恢复细胞稳态;但强烈持久的刺激会引起内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ER Stress),UPR就会启动细胞死亡程序,损伤细胞和组织。内质网应激参与到肿瘤、脑中风和阿尔茨海默病等多种疾病的发生发展中。近年来研究发现,内质网应激在机体的炎症反应中发挥重要作用,TIPE2是否通过调控ER Stress参与到脑缺血再灌注炎症目前尚未见报道。脑缺血再灌注引起内质网应激一方面通过改变细胞的转录和翻译清除过多的未折叠蛋白恢复细胞稳态,另一方面持续的内质网应激也是引起炎症反应的重要原因,但其具体的分子机制尚不清楚。脑缺血再灌注炎症反应是典型的非感染性炎症反应,固有免疫与适应性免疫参与了炎症的发生发展。固有免疫在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用,通过模式识别受体(PRR)来识别病病原相关分子模式(PAMP)或者损伤相关分子模式(DAMP)。NOD样受体(NLR)是一类细胞内感应PRR,NLRP3炎症小体作为固有免疫的重要组分在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用,课题组前期研究表明其在脑缺血再灌注炎症中发挥重要作用。ER Stress是否通过调控NLRP3参与到脑缺血再灌注炎症反应目前尚未见报道,课题将对TIPE2调控ER Stress进而影响脑缺血再灌注炎症的机制进行初步探索。本课题拟通过大脑中动脉栓塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)和细胞糖氧剥夺模型(Oxygen and Glucose Deprivation,OGD)从体内动物实验和体外细胞实验两方面初步探索TIPE2在缺血再灌注炎症损伤中的作用机制,找到参与CIR损伤的关键靶点,用于缺血性脑血管病的治疗。方法:1.体外验证TIPE2对炎症因子的表达调控小胶质细胞是脑内重要的免疫细胞,约占脑内固有细胞的10%-15%,在脑缺血再灌注炎症中发挥重要作用,课题组前期研究结果表明TIPE2主要表达在小胶质细胞。因此体外实验我们选用小胶质细胞系BV-2进行OGD模拟体内缺血再灌注模型。1.1 通过实时定量RT-PCR、Western blot检测OGD2h再灌注3h、6h、12h、24h后TIPE2的mRNA及蛋白表达变化。1.2通过实时定量RT-PCR检测OGD2h再灌注12h后细胞因子TNF-α,IL-lβ,IL-6,IL-18及趋化因子MCP-1的表达变化。1.3 BV-2细胞体外转染pRK5-TIPE2质粒24h后进行OGD处理,应用实时定量RT-PCR的方法检测炎症因子的表达变化。2.TIPE2通过抑制ER Stress调控脑缺血再灌注炎症反应2.1通过体内实验,初步探讨TIPE2对Bip表达变化的影响:8-10周龄TIPE2-/-鼠建立MCAO脑缺血再灌注损伤模型,通过免疫荧光双标(小胶质细胞标志蛋白CD1 lb和内质网应激活化蛋白Bip双标)及Western blot检测Bip的表达变化,初步探讨TIPE2在脑缺血再灌注损伤中对内质网应激的影响。2.2体外验证TIPE2对Bip的调控:在BV-2细胞中,应用siTIPE2抑制TIPE2表达或应用PRK5-TIPE2质粒过表达TIPE2,Western blot检测Bip的表达变化;同时检测在体外OGD及ER stress激动剂(5mM)、抑制剂4-PBA(10mM)作用下,TIPE2对Bip的表达调控,进一步体外验证TIPE2对Bip的调控。2.3 TIPE2通过ER Stress调控炎症因子的表达:在BV-2细胞中转染PRK5-TIPE2质粒过表达TIPE2,加入内质网应激激动剂TG(5mM)12h小时后RT-PCR以及CBA检测炎症因子的表达;同时BV-2细胞应用siTIPE2抑制TIPE2表达,ER Stress抑制剂4-PBA(10mM)刺激12h后RT-PCR、CBA检测炎症因子的表达。2.4 TIPE2对ER Stress下游通路的调控:在BV-2细胞中,用pRK5-TIPE2质粒过表达TIPE2,OGD2h再灌注12h后Western blot检测ER Stress三条信号通路:PERK,IRE1及ATF6的变化。2.5在体内MCAO模型中,验证TIPE2对ER Stress的调控:8-10周龄TIPE2-/-小鼠及WT型小鼠MCAO模型前24h腹腔注射ER Stress抑制剂4-PBA 2次,100mg/kg/次,预处理后建立MCAO局部缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后通过HE、尼氏以及TUNEL染色观察实验组小鼠皮层和海马损伤的情况,用CBA检测上述模型小鼠血清中炎症因子的表达变化,Western blot检测小鼠脑组织匀浆中Bip以及内质网应激相关蛋白的表达变化。3.初步探索ER Stress调控脑缺血再灌注炎症的机制3.1 ER Stress对炎症的调控及机制探索:体内实验,8-10周龄C57BL/6J小鼠腹腔注射ER Stress抑制剂4-PBA后建立MCAO局部缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后通过Western blot检测Bip,NLRP3的表达变化。体外实验:应用ERStress抑制剂4-PBA(10mM)处理BV-2细胞后进行OGD再灌注实验,通过Western blot检测Bip,NLRP3的表达变化,实时定量RT-PCR检测炎症因子mRNA水平的表达变化。3.2 TIPE2负调控NLRP3的表达:BV-2细胞中转染pRK5-TIPE2质粒过表达TIPE2,Western blot检测TIPE2、NLRP3的表达变化,细胞免疫荧光双标共聚焦观察TIPE2及NLRP3在小胶质细胞内的表达、共定位情况。结果:1.在体外实验中,TIPE2抑制炎症因子的表达1.1 BV-2细胞OGD2h再灌注不同时间点后,实时定量RT-PCR、Western blot结果显示TIPE2 mRNA及蛋白水平在再灌注6h、12h有显著性-降低。1.2 BV-2细胞OGD2h再灌注12h后实时定量RT-PCR结果显示,与对照组相比各细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-18及趋化因子MCP-1的表达均有显著升高。1.3 BV-2细胞体外转染pRK5-TIPE2质粒24h后进行OGD处理,实时定量RT-PCR结果显示,与对照组相比OGD再灌注后各细胞因子的表达均有显著升高,而过表达TIPE2可显著抑制再灌注后炎症因子的表达升高。这些实验结果提示,TIPE2负性调控脑缺血再灌注炎症因子的表达。2 TIPE2通过抑制ER Stress调控脑缺血再灌注炎症反应2.1体内结果显示TIPE2抑制Bip表达:TIPE2-/-小鼠建立MCAO脑缺血再灌注损伤模型,通过免疫荧光双标(小胶质细胞标志蛋白CD l1b和内质网应激活化蛋白Bip双标)发现在缺血2h再灌注24h后,小胶质细胞的数量以及Bip的表达量均明显增多,与野生型小鼠相比TIPE2-/-敲基因鼠脑缺血再灌注后小胶质细胞进一步增多,Bip的表达升高。Western blot结果也显示,与假手术组相比Bip的表达增加;与WT组相比TIPE2-/-组中Bip的升高更明显。这些结果初步表明,TIPE2可以抑制Bip的表达,TIPE2可能通过内质网应激调控脑缺血再灌注炎症反应。2.2 TIPE2抑制Bip的表达:BV-2细胞干预TIPE2表达,Western blot结果显示抑制TIPE2后Bip的表达明显升高;而过表达TIPE2时Bip的表达显著降低。过表达TIPE2可以抑制OGD引起的Bip升高:BV-2细胞过表达TIPE2,Western blot结果显示与对照组细胞相比,OGD2h再灌注12h后Bip的蛋白水平升高明显,过表达TIPE2可以抑制OGD引起的Bip表达水平的升高。过表达TIPE2可以抑制ER Stress激动剂TG引起的Bip升高:BV-2细胞过表达TIPE2,加入ER Stress激动剂TG刺激12h后Western blot结果显示,Bip蛋白表达水平明显升高,过表达TIPE2可抑制由ER Stress的激活而引起的Bip的升高。抑制TIPE2可上调Bip的表达:加入ER Stress抑制剂4-PBA处理后12h后Western blot结果显示Bip的蛋白表达水平显著降低,干扰TIPE2可上调Bip的表达。2.3 TIPE2抑制ER Stress引起的炎症因子的表达升高:BV-2细胞中过表达TIPE2,加入内质网应激激动剂TG(5mM)12h小时后,RT-PCR及CBA结果显示与对照组相比较,TG刺激组炎症因子的表达显著性升高,当过表达TIPE2后可以抑制由TG引起的炎症因子高表达;同时BV-2细胞抑制TIPE2表达,ER Stress抑制剂4-PBA(10mM)刺激12h,RT-PCR及CBA结果显示,与过表达结果一致,4-PBA处理可以抑制炎症因子的表达,抑制TIPE2可以上调炎症因子的表达。2.4 TIPE2抑制PERK及IRE1信号通路的激活:BV-2细胞过表达TIPE2,OGD2h再灌注12h后,Western blot结果显示与对照组相比OGD后内质网应激通路中PERK、eIF2α、IRE1的磷酸化水平显著上调,而ATF6无明显变化;过表达TIPE2可显著性抑制PERK、eIF2α、IRE1的磷酸化水平,这提示我TIPE2可以通过抑制PERK-eIF2α和IRE1信号通路对内质网应激进行调控。2.5体内实验表明TIPE2抑制ER Stress:TIPE2-/-小鼠用ER Stress抑制剂4-PBA预处理建立MCAO局部缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后,HE、尼氏染色及TUNEL染色观察发现,缺血再灌注后皮层和海马脑组织均有明显的的损伤和凋亡。与WT组相比TIPE2-/-小鼠组损伤更为严重,4-PBA预处理组可以明显改善TIPE2缺失引起的损伤。CBA结果显示,与WT小鼠组相比TIPE2-/-小鼠组的炎症因子表达明显升高,4-PBA预处理组的炎症因子表达与模型组相比均有一定程度的降低。Westem blot结果也显示,与WT小鼠组相比,TIPE2-/-组中Bip及下游信号通路PERK及IRE1的磷酸化水平均显著升高,4-PBA预处理后PERK以及IRE1的磷酸化水平与模型组相比均有一定程度的降低。3.ER Stress促进脑缺血再灌注损伤的机制3.1体内外结果提示ER Stress影响NLRP3的表达:小鼠腹腔注射ER Stress抑制剂4-PBA预处理后建立MCAO局灶性缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h,Western blot结果显示与假手术组相比,缺血再灌注后Bip以及NLRP3的蛋白表达水平显著性升高,ERstress抑制剂4-PBA可以抑制Bip及NLRP3的表达。体外结果进一步验证ER Stress负性调控NLRP3的表达:抑制BV-2细胞中的TIPE2后加入4-PBA处理12h,Western blot结果显示在OGD再灌注后Bip以及NLRP3表达升高,加入ER-stress抑制剂4-PBA抑制Bip及NLRP3的表达。体内外结果提示ER Stress促炎作用与调控NLRP3的表达密切相关。3.2在BV2细胞中,过表达TIPE2,Western blot及免疫荧光结果显示TIPE2可以明显抑制NLRP3的表达;OGD后可观察到TIPE2的表达降低,NLRP3表达升高;过表达TIPE2质粒可以抑制由OGD引起的NLRP3表达的升高,且TIPE2与NLRP3共定位于细胞浆内。结论:1.TIPE2可以通过抑制内质网应激调控脑缺血再灌注炎症反应。2.内质网应激可以部分通过调控NLRP3促进脑缺血再灌注炎症。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R743.3

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