Tmem88在肝星状细胞中的重要作用及相关机制研究

发布时间：2018-04-16 12:25

本文选题：肝纤维化 + 肝星状细胞　；参考：《安徽医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是一种由多种致肝损伤的因子(例如:HBV或HCV感染、酒精滥用、高脂饮食等)引起的损伤修复反应。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化是肝纤维化发生发展的中心环节,抑制肝星状细胞的活化及增殖是肝纤维治疗的主要策略之一。Wnt/β-catenin通路的激活不仅是肝星状细胞活化的重要标志,并且能够显著地促进肝星状细胞的活化和增殖。跨膜蛋白88(Transmembrane protein 88,Tmem88)是一种双跨膜的蛋白,在人心肌细胞以及非洲爪蟾的胚胎细胞的研究中发现其能够抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化。Tmem88能否通过阻碍Wnt/β-catenin通路的活化来抑制肝星状细胞的活化与增殖,从而阻碍肝纤维化的发生发展,还未见文献报道。为研究Tmem88在肝纤维化进程中的作用,课题组检测Tmem88在人肝纤维化组织、小鼠原代肝星状细胞以及活化的HSC-T6细胞中的表达变化;通过分别过表达和沉默HSC-T6细胞中的Tmem88,检测Tmem88对于肝星状细胞的活化、增殖及凋亡的影响;通过检测Tmem88基因的甲基化状态,探讨其表达的调控机制,并进一步探究了3种DNA甲基化转移酶对其表达的调控作用。本文主要研究内容包括下面4个部分:1.Tmem88在人肝纤维化组织、小鼠原代肝星状细胞以及活化的HSC-T6细胞中的表达变化临床标本:从临床收集新鲜的人肝癌组织,HE和Masson染色观察肝脏病理改变,根据病理分级,将肝组织分为对照组(Control)和纤维化组(Fibrosis)。分别提取肝纤维化组织以及对照组肝组织,应用Western Blot、免疫组化技术检测Tmem88的表达变化。结果显示:Tmem88在人肝纤维组织中的表达显著降低。动物实验:将24只C57BL/6小鼠(雄性,20~22g)随机分为对照组(Control)和肝纤维化模型组(CCL4),每组12只。模型组小鼠背部皮下注射20%CCL4橄榄油溶液,每周2次,持续4周;对照组给予相同剂量的橄榄油溶液。停止注射CCL4后的第二天分别处死对照组和模型组中的小鼠,收集血清、肝脏标本以及原代的肝星状细胞待用。HE染色和Masson染色观察肝脏组织结构的病理变化,生化指标检测血清ALT和AST水平。免疫荧光双染、免疫组化、QPCR以及Western Blot检测Tmem88的定位和表达情况。结果发现:(1)小鼠肝纤维化模型建立成功;(2)Tmem88主要表达于小鼠的肝星状细胞中;(3)Tmem88在肝纤维化小鼠的原代肝星状细胞中表达下降。细胞实验:HSC-T6细胞经10ng/ml的TGF-β1刺激活化24h后,分别采用QPCR和Western Blot技术检测Tmem88在活化的HSC中的表达变化。结果显示:Tmem88在TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞中表达显著降低。2.过表达Tmem88对HSC-T6细胞活化、增殖以及凋亡的影响应用QPCR和Western Blot技术检测HSC-T6中活化标志蛋白(Col1α1和α-SMA)的表达变化,明确过表达Tmem88对HSC-T6细胞活化的影响;其次运用MTT检测HSC-T6细胞的细胞活力变化,流式细胞仪检测细胞周期分布,明确过表达Tmem88对HSC-T6细胞增殖的影响;应用Western Blot技术检测过表达Tmem88对HSC-T6细胞中的Wnt/β-catenin活化的影响;应用流式细胞仪检测细胞凋亡的分布,Western Blot技术检测HSC-T6中凋亡相关蛋白(Caspase3、Bcl-2和Bax)的表达变化,明确过表达Tmem88对HSC-T6细胞凋亡的影响。结果发现:过表达Tmem88可以逆转TGF-β1诱导的HSC-T6细胞活化,通过阻碍Wnt/β-catenin通路活化能够抑制TGF-β1诱导的HSC-T6的增殖并使细胞周期阻滞在G0/G1期,并且能够促进活化的HSC-T6细胞的凋亡。3.沉默Tmem88对HSC-T6细胞活化、增殖以及凋亡的影响应用QPCR和Western Blot技术检测HSC-T6中活化标志蛋白(Col1α1和α-SMA)的表达变化,明确沉默Tmem88对HSC-T6细胞活化的影响;应用Western Blot技术检测沉默Tmem88对HSC-T6细胞中的Wnt/β-catenin通路活化的影响;应用Western Blot技术检测HSC-T6中凋亡相关蛋白(Caspase3、Bcl-2和Bax)的表达变化,明确沉默Tmem88对HSC-T6细胞凋亡的影响。结果发现:沉默Tmem88可以促进TGF-β1诱导的HSC-T6细胞活化,强化Wnt/β-catenin通路的活化,并且能够抑制活化的HSC-T6细胞中凋亡相关蛋白的表达。4.DNA甲基化转移酶对Tmem88表达的影响RRBS筛选结果发现Tmem88基因的甲基化程度在肝纤维化小鼠的原代肝星状细胞中是正常对照小鼠的158倍。在卵巢癌的研究中也发现Tmem88的蛋白表达与其基因启动子区域的甲基化状态相关。课题组进一步观察了Tmem88的甲基化调控机制。课题组应用了DNA甲基化抑制剂5-Azad C(2umol/L)处理TGF-β1诱导活化的HSC-T6细胞,应用Western Blot技术分别检测Tmem88以及活化标志蛋白(Col1α1和α-SMA)的表达变化;提取小鼠原代肝星状细胞以及活化的HSC-T6细胞中的蛋白,应用Western Blot技术检测三种DNA甲基化转移酶(Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b)的表达变化;分别沉默HSC-T6细胞中的三种DNA甲基化转移酶经TGF-β1活化后,应用Western Blot技术检测细胞中Tmem88的表达变化。结果发现:(1)5-Azad C能够恢复Tmem88在活化的HSC-T6细胞中的表达;(2)Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的蛋白水平在肝纤维化小鼠的原代肝星状细胞以及活化的HSC-T6中均显著升高;(3)沉默Dnmt3a能够恢复Tmem88在活化的HSC-T6中的蛋白表达。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2

【参考文献】