硒代蛋氨酸对AD小鼠脑内神经再生的影响
本文选题：阿尔茨海默症 + 神经再生 ； 参考：《深圳大学》2017年硕士论文
【摘要】：目的:阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是常见于老年期的一种神经退行性疾病。大脑中的β淀粉样蛋白(amyloid myloid,Aβ)聚集形成的斑块沉积和过度磷酸化Tau蛋白聚集导致的神经纤维缠结被公认为是AD的主要病理特征。对于AD来说,维持神经系统的完整性以及神经元正常功能是治疗的最终目的。神经再生在维持脑认知及神经功能方面具有重要作用,并且神经再生缺陷是导致AD认知障碍的重要因素。目前,靶向诱导神经干细胞(Neural stem cell,NSC)的再生被认为是治疗AD的有效策略之一。硒代蛋氨酸(Selenomethionine,Se-Met)是动物体摄入有机硒的主要形式,我们的前期研究发现硒代蛋氨酸能够改善三转基因(Psenl、APPSwe、tauP301L)(3×Tg)AD小鼠的认知障碍,逆转突触损伤。本实验采用3×Tg AD小鼠从体内探索Se-Met对成年3×TgAD小鼠脑内海马区NSCs再生分化以及对神经系统的修复作用;同时分离3×Tg原代NSCs,体外实验探究Se-Met对NSCs增殖分化的影响及相关分子机制,为特异性治疗AD的药物研究提供科学依据。方法:1)体外实验:分离培养新生3×TgAD鼠海马原代NSCs,流式细胞仪分选CD133+ CD24+的NSCs,细胞活力检测试剂盒筛选Se-Met作用的最佳浓度及时间,免疫荧光及形态学检测Se-Met对NSCs增殖的影响,同时Western-blot 法检测以下蛋白水平的变化:PI3K,Akt,GSK3β,β-catenin,Cyclin-D等。10βM Se-Met持续作用三周之后,通过免疫荧光检测NSCs向神经元(MAP2+)和星型胶质细胞(GFAP+)的分化,以及形态学分析观察分化后的神经元形态及特征。2)体内实验:Se-Met以6μg/mL浓度溶解于4月龄3×Tg AD小鼠的饮用水中,持续给药三个月后,采用免疫荧光检测3×Tg AD小鼠脑内海马区NSC(Nestin+)、新生神经元(BrdU+NeuN+)数量的变化,以及未成熟神经元(DCX+)和成熟神经元(NeuN+)形态,数量,密度及分布变化。Western-blot法检测相关信号通路蛋白水平的变化:PI3K,Akt,GSK3β,β-catenin,Cyclin-D 等。结果:1)体外实验:我们首先从新生3×TgAD小鼠海马区分离NSC,经过流式细胞仪分离出CD24+和CD133+双阳性的NSC行培养。CCK-8检测发现低浓度(1,5,10μM)的Se-Met能够促进NSCs的增殖,而高浓度的(50,100μM)Se-Met则抑制NSCs的增殖。BrdU免疫荧光检测发现,10μM Se-Met处理48h之后NSCs数量明显增加。通过形态学观察发现,Se-Met组作用之后NSCs形成神经球的速度和成球的大小均显著增加(**p＜0.01)。在机制研究方面,我们发现Se-Met能够显著提高Wnt信号通路中的关键激酶β-catenin的活性(*p＜0.05);并且显著促进其下游Cyclin-D的表达(*p＜0.05)。此外Se-Met组中PI3K和Akt的蛋白表达水平均显著增加(**p＜0.01,*p＜0.05)。10μM Se-Met 持续作用三周之后,形态学观察分析结果显示,NSC 大多分化为神经元;通过免疫荧光检测MAP2+标记的神经元发现,Se-Met组中的神经元数量,树突棘密度和大小都有明显的增加,另外,Se-Met作用后,原浆型星形胶质细胞数量有明显上升,纤维型星形胶质细胞数量有减少;免疫印迹检测发现,Se-Met组中神经元蛋白NeuN水平显著上升,星形胶质蛋白GFAP水平显著下降(*p0.05,*p＜0.05)。2)体内实验:Se-Met(6μg/mL)治疗 90 天后,免疫荧光发现,七月龄AD小鼠海马区Nestin+标记的NSCs数量、NeuN+标记的成熟神经元数量和DCX+标记的未成熟神经元密度都有明显上升,GFAP+星形胶质细胞的数量有所下降;同时BrdU+新生神经元的数量有一定上升;免疫印迹检测相关蛋白激酶蛋白水平发现,β-catenin的活性显著上升(*p0.05),Cyclin-D的水平有上升趋势,GSK3β的活性显著下降(*p＜0.05),PI3K及Akt的活性均显著增加(**p＜0.01,**p＜0.01)。结论:Se-Met能够通过激活PI3K/Akt/Wnt/β-catenin信号通路促进成年小鼠脑内NSCs的再生,并且能够促进NSCs向神经元分化,从而填补受损的神经系统,改善3×TgAD小鼠的认知和记忆能力,这是首次证实硒类化合物对于神经再生促进和调控作用,为Se-Met对AD治疗效应提出脑修复相关机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：深圳大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R749.16
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本文编号：1763441
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