中药多糖介导的miRNA纳米传递与细胞重编程的研究

发布时间：2018-05-10 15:07

本文选题：体细胞重编程 + miRNA　；参考：《江苏大学》2017年硕士论文

【摘要】：一些病因复杂、治疗困难的疾病如恶性肿瘤、阿尔兹海默症、帕金森病、先天性遗传缺陷等和各种组织器官损伤,运用传统的医学手段通常难以达到理想的治疗效果,再生医学的产生解决了这一难题。随着生命科学技术和治疗理念的更新和发展,再生医学已经涵盖了包括组织工程、细胞和细胞因子治疗、基因治疗等在内的多个方面。在细胞移植治疗中,针对不同的疾病需要选用不同的细胞种类,进而制定不同的治疗方案,因此细胞来源极其重要。体细胞重编程技术的产生解决了细胞来源的问题,其可以将体细胞转变为任何一种细胞。本课题创新性地以多糖修饰的磷酸钙纳米粒子载体包载miRNA质粒介导体细胞重编程,将人脐带间充质干细胞(Human Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells,HUCMSCs)诱导为诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells,iPS),以解决再生医学中种子细胞的来源问题。全文主要由五个章节构成:第一章综述本章节主要对细胞重编程技术进行简介,其中比较高效的方法是外源因子诱导法,包括小分子诱导、miRNA诱导、转座子、多顺反子质粒和非病毒载体介导的瞬时转染等。比较了病毒载体和非病毒载体在细胞重编程方面的应用和优缺点。考虑到安全性和生物相容性,非病毒基因载体的优势开始体现出来,来源广泛的、以中药多糖为代表的天然多糖优点众多,在非病毒基因载体材料的研究领域中显示出广阔的应用前景。三维体系能够提高基因转染效率,因此也被应用到细胞重编程中。第二章中药多糖的提取分离与纯化及阳离子化中药多糖的制备与表征本章主要对丹参多糖进行提取分离纯化,经过大孔树脂、5%乙醇洗脱得到不含有蛋白和核酸、纯度较高的丹参多糖SMP。高效液相色谱分析显示SMP多糖只有一个单峰,SMP的分子量为11455 Da。用席夫碱法对SMP多糖进行阳离子化(乙二胺修饰);对阳离子化多糖进行元素分析,N含量为6.18%;傅立叶红外光谱(FT-IR)显示1630 cm-1处出现N-H弯曲振动吸收峰,阳离子化中药多糖的Zeta电位为+7.29m V,凝胶电泳实验结果显示阳离子化多糖具有基因携带能力和对质粒的保护作用。第三章miRNA中药多糖混杂磷酸钙纳米粒的制备、表征及转导效率研究本章制备阳离子化丹参多糖修饰包载miRNA质粒的磷酸钙混杂纳米粒,并对混杂纳米粒子进行表征。CSMP-CPNPs-pmiR-302abcd和CSMP-CPNPspmiR302/367混杂纳米粒子的Zeta电位分别为+6.54 m V和+5.88 m V,粒径在200nm以内,透射电镜显示纳米粒子呈球状或类球状。红外光谱结果显示,所制备的磷酸钙纳米粒中含有阳离子化丹参多糖,表明阳离子化丹参多糖成功链接/包载在纳米粒子中。纳米粒细胞毒性小,转染效率高。凝胶电泳结果显示纳米粒子能够包载质粒,细胞转运机制结果显示miRNA混杂纳米粒子在体细胞的转导涉及网格蛋白的内吞途径和小窝蛋白介导的内吞途径,内涵体-溶酶体系统也对复合物的有效转染发挥着重要作用。而巨胞饮介导的内吞途径不参与混杂纳米粒的摄取,细胞骨架微丝介导混杂纳米粒的胞内运输,但细胞骨架的抑制不利于混杂纳米粒的转染。当多糖-磷酸钙纳米粒与miRNA质粒的质量比为160:1,细胞数2×106个/m L,转染四次时,转染效果最好。第四章miRNA中药多糖混杂磷酸钙纳米粒介导的体细胞重编程及其机理研究本章以miRNA混杂纳米粒为载体,转染HUCMSCs细胞,考察重编程效果,实验结果表明,混杂纳米粒转染四次后,出现克隆团,所形成的克隆团均具有形态小、核质比高、集落致密、边缘清晰的特点,碱性磷酸酶染色结果为阳性,免疫荧光和Western Blot表明iPS高表达Sox2、Oct4、SSEA3、Tra-1-81、Nanog等多能干细胞特异性标志分子。iPS具有体内外的三胚层诱导分化能力,在体外能够诱导分化为外胚层的神经细胞、中胚层的软骨细胞、内胚层的肝脏细胞;在体内能够形成三胚层的各种组织,包括外胚层的神经、中胚层的脂肪和肌肉以及内胚层的腺体。iPS具有全能性基因和三胚层分化基因,形成的拟胚体(EB)在体外不能长时间维持其多能性和三胚层分化能力。对体细胞重编程的机制进行研究,发现miRNA通过抑制NR2F2基因表达,靶向下调NR2F2的mRNA和蛋白水平,拮抗TGF-β2,抑制细胞的上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),进而发生体细胞重编程;miRNA还可以直接抑制TGF-β2受体,下调smad2/3和psmad2/3的表达,从而促进体细胞的重编程。表明所制备的中药多糖非病毒miRNA载体具有高生物相容性、高安全性和低致癌风险,能够为生产可用于临床的重编程细胞提供理想的途径。第五章纤维蛋白支架中miRNA混杂纳米粒子介导的体细胞重编程本章将纤维蛋白原和凝血酶按照一定比例制备适合细胞生长的三维支架,用扫描电镜进行表征,筛选出最佳的纤维蛋白支架并用于三维体细胞重编程。制备方法简单,细胞重编程效率极大提高。实验结果表明:选用50 mg/m L纤维蛋白原加10μL 100 U/m L凝血酶制备纤维蛋白胶,所制备的支架疏松多孔,孔径在50-100μm之间,适合细胞生长。纤维蛋白胶中的细胞比二维状态下的细胞生长更好,增殖更快。纤维蛋白支架中在2-4天左右出现克隆团,碱性磷酸酶染色结果阳性。免疫荧光鉴定,克隆团阳性表达Nanog、Tra-1-81、SSEA3等iPS/ES细胞特异性蛋白。对克隆团进行石蜡包埋切片和HE染色、免疫组化鉴定,阳性表达Sox2和Oct4,可以确定三维支架中所形成的克隆团为iPS细胞。纤维蛋白支架的生物相容性好、孔径合适,能够为细胞提供类似于体内的三维环境,且重编程效率高,所需时间短,可能为体细胞重编程在临床上的应用提供一个新的、高效的策略。
[Abstract]:This paper introduces the application and the advantages and disadvantages of the traditional medicine technique , including small molecule induction , miRNA induction , transposon , polycistronic plasmid and non - viral vector mediated transient transfection . The results of gel electrophoresis show that the cationic polysaccharides have the capability of carrying genes and the protective effect on plasmids . In chapter 3 , the preparation , characterization and transduction efficiency of the hybrid nanoparticles are as follows : In the fifth chapter , we can provide a new and efficient method for cell reprogramming . The results show that the prepared traditional Chinese medicine polysaccharide non - viral miRNA vector has the advantages of high biocompatibility , high safety and low carcinogenic risk , and can be used for the cell growth . It is shown that the prepared traditional Chinese medicine polysaccharide non - viral miRNA vector has high biocompatibility , high safety and low carcinogenic risk . The method is simple in preparation method and high in cell reprogramming efficiency .

【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R28

【参考文献】