龙胆苦苷多克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

发布时间：2018-05-19 09:19

  本文选题：龙胆苦苷 + 人工抗原　； 参考：《陕西科技大学》2017年硕士论文

【摘要】：龙胆苦苷(GTP)是药用植物秦艽中的主要有效成分,也是测定其品质的质量控制指标成分。龙胆苦苷具有保肝利胆、镇痛、健胃、降压、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等药理作用,现已广泛应用于临床。随着对龙胆苦苷药理作用研究的深入,需求量不断上升,致使野生秦艽资源保有量急剧下降,现已被列为国家三级濒危保护药材,在利益驱使下假冒伪劣秦艽药材在市场上随之出现。因此,建立一个低成本、高效率的龙胆苦苷检测技术尤为重要。酶联免疫吸附测定法(ELISA)作为小分子化合物检测分析中的一种新兴技术,在中药有效成分的检测分析中备受关注。与传统的检测方法相对比,ELISA方法具有特异性强,灵敏度高,操作便捷,样品前处理工艺简单,无需使用精密仪器,对操作人员技能要求不高等特点,所以,非常适用于基层快速检测。具体研究结果如下:(1)利用琥珀酸酐法对龙胆苦苷进行结构修饰,其目的是为了引入能与载体蛋白直接进行偶联的活性基团——羧基。薄层色谱法(TLC)鉴定结果表明修饰后确有一种新物质生成,且纯度较高;质谱技术(MS)鉴定结果显示修饰后产物的分子量与理论值相符,这表明已成功获得了羧基化的龙胆苦苷。(2)利用混合酸酐法将羧基化的龙胆苦苷与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)成功偶联,获得了龙胆苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA。组合利用TLC法、红外光谱法(IR)、紫外-可见分光光度计法(UV)、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和三硝基苯磺酸法(TNBS)进行分析鉴定,结果均表明已成功获得了龙胆苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA,并且以TNBS法测得龙胆苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA的结合比分别是9:1和6:1。(3)以人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA为免疫原进行免疫实验,并以新西兰大白兔为免疫对象,分别以基础饲料和谷胱甘肽抗应激饲料进行喂饲,结果显示谷胱甘肽抗应激饲料组的大白兔在体重、精神状态、活动状态、皮毛色泽和食欲状况等指标均优于基础饲料组,表明谷胱甘肽可有效缓解免疫动物在免疫过程中所产生的应激反应,为动物免疫提供了新思路。(4)建立并优化了间接GTP-ELISA法,结果显示:最适包被液是碳酸盐缓冲液,最适封闭液是山羊血清,最适抗体稀释液是PBS+0.5%BSA,包被抗原的最适工作浓度是1:2000,酶标二抗的最适工作浓度是1:3000。利用间接GTP-ELISA测得各实验组的免疫血清效价均达到了1:12800以上,且以GTP-BSA为免疫抗原所产生的免疫血清效价明显高于以GTP-OVA为免疫抗原所产生的免疫血清效价。(5)建立并优化了间接竞争GTP-ELISA法,结果显示:最适竞争反应时间是40min,最适有机溶剂是10%的甲醇溶液,洗涤液的最适pH值是7.5。利用间接竞争GTP-ELISA法对其灵敏度(IC50)和特异性进行检测,并计算出与5种龙胆苦苷结构相似物的交叉反应率。结果显示:IC50分别是95.2ng/mL、38.9ng/mL、41.5ng/mL和10.9ng/mL;竞争抑制标准曲线的线性回归方程分别为y=18.666x-22.452(R~2=0.9722),y=19.07x-18.3315(R~2=0.9658),y=16.872x-12.188(R~2=0.9714)和y=15.523x-1.4934(R~2=0.9688)。4个实验组与龙胆苦苷的交叉反应率均为100%,对獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的交叉反应率均0.5%,对栀子苷、马钱苷和橄榄苦苷的交叉反应率均0.1%,这表明4个实验组的特异性均良好,尤其是对栀子苷、马钱苷和橄榄苦苷基本没有交叉反应。
[Abstract]:In this paper , it has been widely used in the detection and analysis of the effective components of traditional Chinese medicine . The result shows that the method has the advantages of strong specificity , high sensitivity , convenient operation , simple pretreatment process , high purity and high efficiency . The results showed that the optimal pH value was 1 鈭，

本文编号：1909549