龙葵碱诱导黑色素瘤A375细胞凋亡及其机制的研究

发布时间：2018-06-02 08:18

本文选题：龙葵碱 + 黑色素瘤　；参考：《河北医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一种高度恶性的肿瘤,占皮肤恶性肿瘤的第三位,易发生转移,死亡率高,预后差。因此寻找安全有效的治疗药物成为国内外研究的热点。各国学者一直致力于研发高效、敏感的抗黑色素瘤药物。目前,中草药及其有效成分是肿瘤研究领域的一个新方向。龙葵碱(solanine)又名茄碱,是马铃薯中一种主要的甾体生物碱。近年来发现,龙葵碱具有抗病原微生物、抗肿瘤等作用,其抗肿瘤作用受到众多学者关注。目前,已有研究证实龙葵碱对多种肿瘤细胞具有抑制作用,但其对黑色素瘤细胞的抑制作用研究很少。本研究主要通过龙葵碱处理黑素瘤A375细胞,观察其对A375细胞增殖、凋亡及相关凋亡蛋白的影响,探讨龙葵碱可能的抗肿瘤作用机制,为其进一步临床应用提供实验依据和理论基础。方法:1细胞培养。将黑色素瘤A375细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。2采用CCK8法检测龙葵碱对黑色素瘤A375细胞增殖抑制率的影响。实验设空白对照组(只加培养基无细胞无龙葵碱),阴性对照组(加含有细胞的培养基,无龙葵碱)和实验组(加含有细胞的培养基和以下浓度的龙葵碱4.6μmol/L、9.2μmol/L、13.8μmol/L、18.4μmol/L、23.0μmol/L),每组6个复孔。培养24 h、48 h、72h后加入CCK8检测龙葵碱对黑色素瘤A375细胞增殖活力的影响,计算不同浓度的增值抑制率及IC50值。3倒置显微镜和荧光显微镜观察不同浓度的龙葵碱诱导黑色素瘤A375细胞凋亡的形态学变化。设阴性对照组(无龙葵碱)及实验组(龙葵碱浓度为9.2μmol/L、13.8μmol/L、18.4μmol/L)。培养24小时后分别于倒置显微镜和DAPI染色后荧光显微镜下观察细胞生长情况及形态学变化。4应用实时荧光定量PCR法(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测凋亡相关基因(Caspase-3、Bcl-2及Bax)在mRNA水平的表达。5应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白(Caspase-3、bcl-2及bax)的表达情况。6应用统计学软件spss16.0对数据进行统计学分析,计量资料以x?s表示,多组均数间比较采用单因素方差分析(onewayanova),组内两两比较采用snk-q检验,以p0.05为差异有统计学意义。结果:1未经龙葵碱作用的黑色素瘤a375细胞呈菱形生长,大小一致,形态规整,细胞贴壁良好,增殖旺盛(fig.2,3);2cck8结果示,不同浓度的龙葵碱作用黑色素瘤a375细胞24h抑制率分别为(2.0±2.4)%、(11.4±1.4)%、(36.6±1.8)%、(63.7±0.3)%、(68.4±1.4)%,经两两比较4.6μmol/l与阴性对照组的抑制率无统计学差异(p0.05),其余组间差异具有统计学意义(p0.05);作用48h抑制率分别为(7.6±3.0)%、(15.3±2.8)%、(60.9±3.4)%、(76.6±2.9)%、(78.6±3.8)%,经两两比较18.4μmol/l与23.0μmol/l的抑制率无统计学意义(p0.05),其余组间差异具有统计学意义(p0.05);作用72h抑制率分别为(16.3±1.4)%、(28.7±3.7)%、(64.8±4.4)%、(95.8±1.2)%、(101.1±4.5)%,经两两比较18.4μmol/l与23.0μmol/l的抑制率无统计学意义(p0.05),其余组间差异具有统计学意义(p0.05)(fig.4,5,table1)。实验组龙葵碱作用黑色素瘤a375细胞24h、48h、72h的半数抑制浓度(ic50)分别是16.2μmol/l、12.9μmol/l、11.8μmol/l。因此我们选取9.2μmol/l、13.8μmol/l、18.4μmol/l的龙葵碱浓度作用24h进行后续实验;3倒置显微镜下观察,阴性对照组细胞形态规整,轮廓清楚,大小一致,胞浆饱满,遮光性强,细胞贴壁良好且增殖旺盛;实验组龙葵碱作用24h细胞形态发生变化,体积变小,轮廓不规整,细胞皱缩,遮光性差,细胞脱落,贴壁不良,悬浮细胞增多(fig.6,7)。dapi染色后通过荧光显微镜观察,阴性对照组细胞核大小一致,均匀分布,实验组龙葵碱作用24h细胞核出现核固缩、核边集及凋亡小体形成(fig.8)。且随着龙葵碱浓度的升高,细胞凋亡的形态学变化越显著;4rt-qpcr结果示,不同浓度的龙葵碱作用黑色素瘤a375细胞24h,bax基因在mrna水平表达量依次为1.370±0.335,1.721±0.711,2.371±0.494,阴性对照组为1.064±0.516,经两两比较对照组与9.2μmol/l、13.8μmol/l与18.4μmol/l之间差异无统计学意义(p0.05),其余各组间差异有统计学意义(P0.05)(Fig.9,Table 2);Caspase-3基因在mRNA水平表达量依次为1.346±0.289,1.619±0.299,2.338±0.033,对照组为1.018±0.267,经两两比较对照组、9.2μmol/L与13.8μmol/L之间差异无统计学意义(P0.05),其余各组间差异有统计学意义(P0.05)(Fig.11,Table 2);Bcl-2基因在m RNA水平表达量依次为0.975±0.109,0.705±0.228,0.360±0.110,对照组为1.007±0.166,经两两比较对照组与18.4μmol/L、9.2μmol/L与18.4μmol/L之间差异有统计学意义(P0.05),其余各组间差异无统计学意义(P0.05)(Fig.10,Table 2);5 Western blot结果示,不同浓度的龙葵碱作用黑色素瘤A375细胞24h,Bax蛋白表达量依次为0.543±0.049,0.824±0.059,0.857±0.046,阴性对照组为0.440±0.039,经两两比较浓度为13.8μmol/L与18.4μmol/L之间差异无统计学意义(P0.05),其余各组之间差异有统计学意义(P0.05)(Fig.12,13,Table 3);Caspase-3蛋白表达量依次为0.409±0.050,0.526±0.029,0.613±0.050,阴性对照组为0.403±0.037,经两两比较浓度为9.2μmol/L与阴性对照组之间差异无统计学意义(P0.05),其余各组之间差异有统计学意义(P0.05)(Fig.12,15,Table 3);Bcl-2蛋白表达量依次为0.275±0.026,0.145±0.018,0.045±0.018,阴性对照组为0.254±0.021,经两两比较浓度为9.2μmol/L与阴性对照组之间差异无统计学意义(P0.05),其余各组之间差异有统计学意义(P0.05)(Fig.12,14,Table 3)。结论:1在一定浓度和时间范围内,龙葵碱对黑色素瘤A375细胞具有明显的增殖抑制作用,且呈时间-剂量依赖性。2在一定浓度和时间范围内,龙葵碱可诱导黑色素瘤A375细胞凋亡,且随着浓度的升高,诱导凋亡作用越显著。3龙葵碱诱导黑色素瘤A375细胞的凋亡作用可能与线粒体凋亡通路有关,通过下调Bcl-2/Bax值从而使caspase-3活化。
[Abstract]:Objective : To study the effect of the tumor on the proliferation , apoptosis and apoptosis of melanoma A375 cells . The results showed that the tumor cells could inhibit the proliferation , apoptosis and apoptosis of melanoma A375 cells . The expression of Caspase - 3 , Bcl - 2 and Bax were detected by real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - qPCR ) . The results showed that the inhibition rates were ( 16.3 卤 1.4 ) % , ( 64.9 卤 3.4 ) % , ( 95.8 卤 1.2 ) % , ( 101.1 卤 4.5 ) % , respectively . Conclusion : In a certain concentration and time , the A375 cells can induce apoptosis of melanoma A375 cells in a time - dose - dependent manner . The apoptosis of melanoma A375 cells can be induced with the increase of concentration and time , and the apoptosis of A375 cells may be related to the pathway of apoptosis , and caspase - 3 can be activated by downregulating the Bcl - 2 / Bax value .
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】